线立体的分离

 线立体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线立体内进行的氧化所产生的能量来供给，建立线立体的关键要保持其完整性及纯度。分离的原则可用分级离心方法，低速去除细胞核及细胞碎片后，再用高速梯度离心分离线立体。     操作方法：  所有操作需在4℃下进行。 1．  将饥饿一天的300g雄性大鼠处死迅速取出组织，浸在缓冲液A中（250mM甘露醇， 0.5mmol/L EGTA，5mmol/L Hepes, 0.1%（W/V）BSA，pH7.4），剪碎。 2．  600g×5min离心，2次，去除细胞核及碎片。 3．  上清在10,300g×10min离心，沉淀部分为线立体粗制品部分。 4．  将沉淀部分悬浮于5ml缓冲液A中。 5．  分装4个含有20ml，30%V/V Percoll（用225mmol/L 甘露糖醇，1mmol/L EGTA， 25mmol/L Hepes），0.1%(W/V) BSA，（pH7.4） 离心管 中，95,000g×30min离心。 6．  收集密度底层的褐黄色线立体部分。 7．  6,300g×10min， 缓冲液 A离心洗涤2次。 8．  沉淀加适量 缓冲液 A于－70℃保存。