shRNA设计

【材料】靶细胞，载体

1. 克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由pol Ⅲ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。 2. 两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。 3. Stratagene发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效地抑制目的基因。 4. 在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生。 5. ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G。 6. shRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段的克隆。在比较了众多不同长度和序列的茎环，5'TCAAGAG3'序列最为有效。 7.5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录。 8.在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。这可能导致shRNA转录的提前终止。