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细胞技术

FCM 医学生物学应用和进展

2025-03-10 细胞技术 加入收藏
细胞是一切生物体最基本的结构单位和功能单位。细胞学研究在医学科学乃至生命科学中占有十分重要的地位。近代细胞生物学发展十分迅速,其研究方法逐步从传统的定性描述发展

细胞是一切生物体最基本的结构单位和功能单位。细胞学研究在医学科学乃至生命科学中占有十分重要的地位。近代细胞生物学发展十分迅速,其研究方法逐步从传统的定性描述发展到定量的、细胞群体的研究,以获得更为客观的、具有统计学意义的测量数据,供进一步深入的研究。由此形成了一个新的领域,新的学科,即分析细胞学。流式细胞分析术(FCM)是分析细胞学最重要的组成部分。 分析细胞学也称为定量细胞学。它既是细胞生物学发展中的一个分支,又代表着细胞生物学发展过程中的一个重要阶段。分析细胞学是一个十分年轻的交叉学科,二十多年来发展十分迅速。它的发展是与近代其他一些科学技术的发展密切相关的,其中特别是激光技术、数字计算机技术、电子物理技术、电子摄像技术、光电测量技术、单克隆抗体技术及荧光细胞化学技术等等。 分析细胞学是从定量的角度对细胞的各种形态学参数、生物学特征、细胞生化成分的组成及含量以及细胞的各种功能等进行研究,将以往各种细胞学技术从定性、定位进一步发展到定量的研究,排除了各种主观因素的影响,获得定量的测量数据,更客观地揭示生命活动的规律。随着分析细胞学技术方法学的标准化和质量控制,其各种定量测定数据可以在各实验室之间直接进行比较,这是以往其他技术难实现的。 与传统的将细胞固定在载玻片上的方法不同,FCM 要求将细胞样品悬浮在液体中。这些细胞悬液加入 仪器 后,高速度地流过 仪器 的检测区。仪器对悬液中每一个细胞进行分析测定,记录每一个细胞众多的生物学参数,并可根据预选的条件将其中特殊的细胞亚群分选纯化出来,以供进一步的深入研究。这类仪器统一称为流式细胞仪( Fl o w Cytometer,简称FCM )。 FCM从诞生至今近三十年中经历了进一步发展和完善的过程。其测量参数由单参数向多参数发展,仪器的灵敏度、分辨率、和检测速度等指标进一步改善提高。目前FCM 的商业生产向两个方向发展。一个方向是发展小型的操作简便、性能指标稳定的临床常规型FCM仪器。这种仪器使用方便,价格较低,能满足大部分临床医学工作的要求,但一般不附加有细胞分选功能。另一个方向是发展科研型 FCM。这种仪器各种功能较强,并且配备各种分选装置,可以满足各种研究的众多要求。但一般价格昂贵,操作调试较复杂。 回顾历史,细胞生物学的每一重大发展都是与其研究手段上的革命分不开的。FCM是继电子显微镜技术后细胞学研究手段的重大进展。这种技术能高速度地自动分析单个细胞的多个生物学特征或多种细胞生化成分的含量,一般在一、二分钟内就能完成对细胞大群体的定量分析测定。这种细胞大群体的分析数据具有很高的统计学精度,同时单亇细胞的多参数相关分析可获得更多、更精确的信息。这是以往任何细胞学分析技术不可比拟的。FCM还可在多参数测定的基础上,结合多种细胞生物学特性,将样品中特殊的细胞群体高纯度地分选( sorting ) 出来,单独收集以供进一步的深入研究。 FCM从原理上讲是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。FCM是对细胞的结构和功能进行定量测量的一种高速度、高精度、多信息分析的新技术。近年来,该技术发展十分迅速,应用也层出不穷,已在生物医学基础和临床研究领域得到广泛应用。另外,FCM作为高精度的单细胞定量分析的仪器,对细胞样品的制备技术有着特殊的要求。因此我们应该对细胞样品制备工作应有足够的重视,同样,细胞样品制备技术的发展对流式细胞术的应用发展也起着十分重要的推动作用。 FCM在医学生物学的各领域中已有广泛的应用。它的研究对象是各种类型细胞,可以是正常细胞,也可以是异常细胞。FCM也可以悬浮在液体中的非生物颗粒为研究对象,这是FCM近年发展的重要方向之一。由于FCM有现代电子技术和计算机技术的支持,使整个细胞检测分析等工作高度自动化,保证了所得结果客观、准确。FCM这些独特之处是以往任何其他细胞学技术难以实现的。随着细胞荧光染色技术的发展完善,越来越多的细胞生物学参数和细胞化学成分都有其相应的定量荧光染色方法。并且,以往细胞学多数常用的同位素标记技术,酶标技术等也都有相应的荧光标记方法。荧光标记方法具有灵敏度高,操作制备周期时间短,并可方便地在同一细胞样品上进行多色荧光染色供荧光多参数分析及其定量测定等特点。 FCM在已被广泛的应用于肿瘤,血液病、免疫性疾病、艾滋病、器官移植等方面的常规临床检查中,并已成为上述疾病诊断、疾病监控、治疗选择、疗效判断和预后估计等至关重要、甚至唯一的方法。 FCM以往最常用相对百分率检测来分析被测细胞样品中各亚群组成情况。如在样品中加入己知数量的标准粒子就可测定其中特殊细胞群的绝对计数,如用于各种标本中的CD34+ 细胞绝对计数。近年来,随着荧光素标记技术的发展,现己可定量每亇细胞上各种抗原的绝对表达量。这些技术大大扩大了FCM的应用范围。 FCM作为定量研究细胞各种结构与功能参数的新技术手段在细胞生物学领域有着广阔的应用范围。其中特别是对细胞动力学、细胞周期分析、细胞增殖、细胞分化及细胞凋亡、细胞坏死等方面的研究。 细胞动力学的研究工作以往主要利用放射性同位素标记与放射自显影技术( ARG )和显微分光光度术( MSP )等方法。FCM可快速测定细胞群体中每一细胞的核 DNA含量,从而确定其在细胞周期中所得处的时相;溴化脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine, BrdU )标记方法更可获得细胞核 DNA合成速率的信息等。FCM的这些方法由于其分析测量速度快,工作周期短, 获得的信息量大,数据结果客观准确,统计学精度高,并且不使用放射性污染物质,现已成为细胞动力学研究和细胞周期分析的主要手段。如细胞动力学参数测定,发展对细胞周期的新认识,对各种理化因素及抗肿瘤药物的作用机理研究和抗肿瘤药物合理使用与配伍方案设计等。 细胞的分化往往与细胞的增殖密切相关。研究细胞分化过程中同时分析其增殖过程的变化,常可提供十分重要的信息。FCM分析细胞的分化状态主要是通过检测和定量细胞膜上各种分化抗原进行的。 近年来医学生物学界对细胞凋亡的研究表现出浓厚的兴趣。由于低剂量辐射或某些化学药物较低浓度的作用下,也观察到一些肿瘤细胞发生类似的反应,导致细胞凋亡,整个过程较温和。这为改善抗癌治疗提供了新的途经。细胞凋亡过程中出现的一系列特征性的形态学变化、细胞生化变化以及细胞功能改变等是细胞凋亡FCM检测的基础和依据。如核DNA链多处断裂口的检测,有“切口平移法”或TUNEL 法等,有亚二倍体( Sub-G1 )细胞峰的检测法,有检测细胞膜双层结构不对称性的Annexin Ⅴ 试剂 法以及胞膜通透性改变的FCM检测等。FCM 技术是目前细胞凋亡研究中重要的检测手段。FCM的细胞散射光检测常可提供细胞形态学改变的重要信息。根据对细胞凋亡的不同阶段各种生物学特性变化的进一步认识,又设计出一些新的检测方法,如线粒体膜电位测定和Caspas es 的酶系活性测定等。但是必须记住,细胞凋亡FCM 分析必须与光镜、电镜等形态学检查,与细胞DNA 电泳等一些常规检查方法结合起来综合分析,才能给予正确的评价。 细胞染色体检查是研究人类遗传性疾病和一些肿瘤疾病的重要手段。传统的染色体分析一般都是在显微镜下进行的。通过制备细胞染色体的悬浮液,荧光染色后经FCM 快速分析,可对各条染色体出现频数、各染色体DNA含量及碱基组成比例等进行定量的分析,称为流式核型分析 ( Flow karyotype )。在此基础上,FCM还可将特定的染色体分选纯化出来,供染色体DNA文库等分子生物学的研究。 FCM流式细胞分析技术从它问世开始就与免疫学研究紧密地联系在一起。目前,除T、B 淋巴细胞及其各亚群分类外,单核细胞、粒细胞、吞噬细胞、骨髓干细胞、各系各分化阶段的造血细胞以及各种活化细胞、异常细胞和肿瘤细胞等等都可以通过细胞膜抗原检查加以分析鉴定。正常造血细胞发育过程中各系细胞的各个分化阶段细胞膜的免疫表型变化已有大量研究。这些细胞膜上的抗原在其分化成熟过程的不同阶段出现或消失,或表达增强,或表达降低,都遵循一定的规律。进一步研究表明这些抗原都是具有一定生物学功能的效应分子,它们参与造血细胞发育成熟过程中的免疫应答和调控作用。

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