酸性磷酸酶金属盐―铅法

酸性磷酸酶金属盐―铅法 酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)广泛分布于机体各种组织细胞内，主要存在于细胞的溶酶体内．常作为溶酶体标志酶，此外，还存在于内质网和胞质内。在组织退行性变、核酸和蛋白质代谢活动增加时，酸性磷酸酶活性增强。酸性磷酸酶还参与酯类代谢。因此，它在疾病、免疫反应和细胞损伤与修复过程中具有一定生物学意义。 其基本原理是在酸性环境下，底物p―甘油磷酸钠被酸性磷酸酶水解，释放出磷酸，磷酸遇铅离子则生成磷酸铅沉淀，最后与硫化铵作用形成棕褐色硫化铅沉淀。其反应式如

1)孵育液配制：

0.05mol儿醋酸盐缓冲液(pH 5．0) 10ml蔗糖 0．8mg硝酸铅 l0mg3％p―甘油磷酸钠 lml孵育液最终pH 5．0，新鲜配制尽快使用。

按上述顺序加入后待硝酸铅完全溶解，逐次少量加入底物时，孵育液则变得完全透明。醋酸盐缓冲液需新鲜配制，立即使用。

2)染色程序：

①新鲜组织恒冷箱切片；

②10％福尔马林固定10分钟；

③蒸馏水洗；

④人孵育液，37C孵育2～4小时；

⑤双蒸水洗2―3分钟；

⑥入1％硫化铵液(新鲜配制)l一2分钟；

⑦蒸馏水冲洗；

⑧甘油明胶封固。

3)结果与评价：

阳性反应部位呈棕褐色硫化铅颗粒。该酶为可溶性酶，以冷固定效果较好，一般溶酶体膜为不通透性膜，但经冰冻熔化或福尔马林固定处理后，孵育液内的作用底物则进入溶酶体而被酶作用。

酸性磷酸酶铅法染色

大鼠肾小管上皮细胞呈棕色为酸性磷酸酶肛拦反应

4)注意事项：

孵育液内铅离子浓度是反应的关键因素，必须新鲜配制，立即使用。因为当铅离子浓度过低时，产生的磷酸离子未能完全被结合而发生弥散，并可进入胞核内造成染色假阳性。孵育时间过长也可发生酶扩散和胞核染色现象。

5)对照实验：

①去底物实验：从孵育液中除去底物(3％β―甘油磷酸钠)，通常反应为阴性；

②抑制剂实验：氟化钠是ACP的抑制剂，在孵育液中加入氟化钠(10mmol／L或4．2mg／10mi)，ACP反应呈阴性。

但某些部位如脊髓背角浅层和初级感觉神经节中小细胞内的ACP活性不能被一定浓度的NaF所抑制，称抗氟化钠ACP。