三磷酸胶瞽酶钙―钴法

三磷酸胶瞽酶钙―钴法   三磷酸腺苷酶可水解磷酸与磷酸之间的高能键，而释放大量能量，而磷酸酶是酯酶，能水解磷酸与碳酸之间的键。反应式如下：     A--P～P～P+H2O ATPase A―P―P+ H3PO4+能量     在生物膜上，ATP酶的功能是参与离子泵的主动运输，因此细胞膜呈强阳性，ATP酶可作为肝细胞早期受损的敏感指标。此酶活性在心肌最高，其次为骨骼肌、肺、肾脏、脑和胰腺。由于各种ATP酶的最适pH值不同，故所用显示方法也不同。下面仅介绍显示Ca2+ATPase的钙―钴法。三磷酸腺苷酶钙―钴法类似碱性磷酸酶的钙―钴法，但底物改用三磷酸腺苷钠盐，最适pH 9．4，对ATP酶型Mg2+具有抑制作用。     1．孵育液配制    0．1mol/L巴比妥钠(pH 9．4)                2．0ml    三磷酸腺苷二钠盐                          30mg    蒸馏水                                    1．0ml    0．18mol儿氯化钙                          1．0ml    0．1mol/LNaOH调至pH 9．4，蒸馏水加至      10ml     2．染色程序    (1)新鲜组织冷丙酮固定30分钟，冰冻切片；    (2)人孵育液(新鲜配制)37~C孵育3小时后蒸馏水漂洗；    (3)1％CaCl2溶液洗2分钟；    (4)蒸馏水洗；    (5)1％CaCl2溶液洗2分钟；    (6)流水洗；    (7)人1％硫化铵1分钟；    (8)流水洗；    (9)干燥后梯度乙醇脱水，二甲苯透明；    (10)甘油明胶封固。     3．结果  酶活性处显示黑棕色。     4．对照实验  ①用β―甘油磷酸钠代替ATP钠盐应为阴性；②孵育液中加入ι―四咪唑抑制碱性磷酸酶排除假阳性；③去底物。     5．注意事项  此法要求Ca：―浓度在孵育前后不能降低，否则产生的磷酸根离子不能被完全捕获而影响准确定位。如染色效果不好可在孵育前将切片放入1％CaCl2溶液中，37℃作用5分钟。