一氧化氮合酶组织化学染色法

一氧化氮合酶组织化学染色法 一氧化氮合酶(nitrfic oxides synthase，NGS)是一种连接酶，能催化前体物质L精氨酸生成L瓜氨酸和一氧化氮(NO)。NO是中枢和外周神经系统中的一种神经递质，活细胞间信使和内皮源性松弛血管的介质，在神经、心血管及免疫系统中有广泛的作用。NO极不稳定。易于扩散游离，半衰期短，不易检测。因NOS是合成NO的关键酶，故通常通过检测NOS的活性来评估NO的分布和功能。NOS有3种异构型，即神经型NOS(neuronal NOS，nNOS)、内皮型NOS(endothelial NOS。eNOS)和细胞因子诱导型NOS(inducible NOS，iNOS)。由于还原型辅酶Ⅱ―黄递酶(NADPH-d)与NOS在化学结构和组织定位上有极高的一致性，且也与NO生成密切相关．故人们常采用NADPH-黄递酶法来显示NOS活性。 1．原理 在βNADPH存在下，NOS的C末端能将NADPH电子转移到NBT，将NBT还原成不溶性蓝紫色甲腊沉淀产物。 2．孵育液配制 β―NADPH 10mg NBT 5mg Triton X―100 0．03ml 0．05mol/L TB(pH 8．0) 9．97ml 临用前配制。 3．染色程序 (1)固定：4％多聚甲醛(0．1mol/LPBS配制)灌流固定，取材后入同样固定液再固定1小时(4℃)，20％蔗糖中4℃过夜； (2)冰冻切片：厚10―401．Lm； (3)孵育：切片人孵育液中37％孵育30分钟～1小时； (4)终止反应：切片人0．05mol/LTB或蒸馏水中；分钟； (5)常规脱水、透明、封片或直接用甘油明胶封片。 4．结果与评价 反应产物为蓝色或蓝紫色沉淀。NADPH-黄递酶法显示NOS活性，方法简便经济，应用广泛，但不能区分NOS亚型。 5．对照实验 在孵育液中除去β―NADPH或用0．1mol/L N―亚硝基精氨酸(NOS抑制剂)预孵育切片1小时，结果应为阴性。