免疫荧光技术之染色方法

一、制片

选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。

二、固定

除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。

固定的作用有三：

1. 防止标本从玻片上脱落。

2. 除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果。

3. 固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。

标本的固定原则是：

1. 不能损伤细胞内的抗原。

2. 不能凝集蛋白质。

3. 不能损伤细胞形态。

4. 固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。

三、水洗

固定后以冷的0.01 Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。

四、染色

染色分直接染色法与间接染色法。

1. 材料与试剂

（1）荧光抗体，稀释至应用浓度。

（2）0.01 Mol/L pH7.4PBS液

（3）9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。

（4）带盖方盘

2. 直接染色法

（1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30 min~45min。

（2）PBS冲洗3次，每次冲洗3 min，即3×3冲洗。

（3）蒸馏水冲洗。

（4）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。

3. 间接染色法

（1） 检查抗原： ①取固定标本，加已知的免疫血清，37℃孵育30 min。 ②以PBS液3×3冲洗。 ③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30 min。 ④PBS 3×3冲洗。 ⑤H2O冲洗，凉干。 ⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。

（2）检查抗体： ①免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定。 ②滴加相应抗原液（按1：100~1：500稀释），37℃孵育30 min。 ③PBS液3×3冲洗。 ④加荧光抗体，37℃孵育30 min。 ⑤PBS液3×3冲洗。 ⑥水洗，凉干。 ⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。