随机RNA文库的SELEX筛选
原理SELEX 技术是一种利用随机寡核苷酸（DNA 或 RNA）文库筛选靶分子的特异性配基的组合化学技术。最常用的是随机 RNA 文库，因为 RNA 分子中除
原理
SELEX 技术是一种利用随机寡核苷酸（DNA 或 RNA）文库筛选靶分子的特异性配基的组合化学技术。最常用的是随机 RNA 文库，因为 RNA 分子中除 G-C、A-U 碱基对以外，还有 G-U 等变偶碱基对的存在，可以形成发夹、假结、凸环、G-四聚体等多种空间结 构，它们与靶分子通过氢键、范德华力等相互作用，或嵌合，或包被，形成稳定的复合物。 即使很小的一段 RNA 分子也能形成相当稳定的刚性结构。一个包含 25 个随机序列的随机 RNA 文库理论上可以产牛 425~1015 个具有不同空间结构的 RNA 分子，拥有巨大的筛选潜力。
材料与仪器
X 线胶片 可拆卸酶联板 蛋白 A sepharose 凝胶 micropure-EZ 脱酶管和 microcon-脱盐管 pGKM-T 载体 RiboMAXTM 大体积转录试剂盒 AMV 反转录酶 T4 DNA 连接酶 pfu Taq DNA 聚合酶 r Taq DNA 聚合酶
dNTP 混合液 rNTP 混合液 DNA 凝胶洗脱缓冲液 RNA 凝胶洗脱缓冲液 SHMCK 缓冲液 封闭液 滤膜洗脱液 NT2 缓冲液 RNA 结合缓冲液 蛋白酶 K 缓冲液
电泳仪 PCR 仪 离心机 凝胶成像仪 液体闪烁仪 长波紫外灯 紫外分光光度计 核酸定量仪 pH计 培养箱 振荡器 洁净工作台
dNTP 混合液 rNTP 混合液 DNA 凝胶洗脱缓冲液 RNA 凝胶洗脱缓冲液 SHMCK 缓冲液 封闭液 滤膜洗脱液 NT2 缓冲液 RNA 结合缓冲液 蛋白酶 K 缓冲液
电泳仪 PCR 仪 离心机 凝胶成像仪 液体闪烁仪 长波紫外灯 紫外分光光度计 核酸定量仪 pH计 培养箱 振荡器 洁净工作台
步骤
一、材料与设备
1. 仪器设备：电泳仪，PCR 仪，离心机，凝胶成像仪，液体闪烁仪，长波紫外灯，紫外分光光度计，核酸定暈仪，pH计，培养箱，振荡器，洁净工作台。
2. 材料：X 线胶片（X-Omat blue Kodak 公司），可拆卸酶联板（丹麦 NUNC 公司），HAWP 膜（13 mm，0.45 μm，Millipore 公司），蛋白 A sepharose 凝胶（HiTRAP 公司），（Millipore 公司），micropure-EZ 脱酶管和 microcon-脱盐管。
3. pGKM-T 载体，RiboMAXTM 大体积转录试剂盒，AMV 反转录酶，T4 DNA 连接酶（Promega 公司）。
4. pfu Taq DNA 聚合酶，r Taq DNA 聚合酶（TaKaRa 公司）。
5. dNTP 混合液：25 nmol/L dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP 每种均为 25 nmol/L）。
6. rNTP 混合液：25 nmol/L rNTP（ATP、CTP、GTP、TTP 每种均为 25 nmol/L）。
7. DNA 凝胶洗脱缓冲液：0.5 mol/L NH4Ac，10 mmol/L MgAc2，0.1% SDS，1 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
8. RNA 凝胶洗脱缓冲液：0.2% SDS，0.5 mol/L NH4Ac，1 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
9. SHMCK 缓冲液：20 mmol/L HEPES（pH 7.35），120 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2。
10. 封闭液：SHMCK 缓冲液 + 0.1% 明胶。
11. 洗涤及洗脱缓冲液：SHMCK 缓冲液+ 0.1% 明胶 + 0.05% Tween-20。
12. 滤膜洗脱液：7 mol/L 尿素，0.5 mol/L NH4Ac，0.2% SDS，1 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
13. NT2 缓冲液：50 mmol/L Tris-HCI （pH 7.4），150 mmol/L NaCl，1 mmoI/L MgCl2，0.05% NP-40。
14. RNA 结合缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），100 mmol/L NaCl，4 mmol/L EDTA，2 mmoI/L MgCl2，0.05% NP 40，0.4% 核苷氧钒复合物（Vanadyl ribomicleoside complex），200 U/ml RNasin，100 μg/ml poly A，100 μg/ml tRNA，50 μg/ml BSA。
15. 2X 蛋白酶 K 缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.8），10 mmol/L EDTA，1% SDS。
二、操作方法
1. 随机 RNA 文库的构建及引物合成
设计一个包含 25 个随机序列，全长 85 个碱基的随机 RNA 文库，此文库两端为固定序列。可设计引物对文库进行 PCR 扩增。根据这一设计，首先要合成随机文库的 ssDNA 模板及其两条引物。
模板和引物序列如下：
5' 引物：5'-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC-3'；
3' 引物：3'-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3'；
ssDNA-G 模板：5'-TAATACGACTCACTATAGCATGGTACGGTACTTCC（25N）CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'；
其中 N 代表随机碱基，下划线部分为 T7 启动子序列，用于转录制备随机 RNA 文库。
2. 起始 RNA 文库的建立
(1) PCR 扩增 ssDNA 模板为 dsDNA
PCR 反应体系如下：10X PCR 反应缓冲液 10 μl，dNTP 混合液 8 μl，5' 引物（25 pmol/μl） 2 μl，3' 引物（25 pmol/μl） 2 μl，ssDNA 模板 0.25 μg，pfu Taq DNA 聚合酶 1 μl，加去离子水补齐至 100 μl。
PCR 反应条件：95℃ 预变性 5 min，4℃ 变性 1 min，37℃ 退火 2 min，72°C 延伸 2 min，扩增 3 个循环，最后 72℃ 终延伸 5 min。
将合成的至少 2OD260 的 ssDNA 模板全部按优化好的条件进行 PCR 以后，用超滤法浓缩纯化 PCR 产物，其操作步骤如下：按从上到下的顺序安装 Micmpure-EZ 脱酶管、Microcon-3 脱盐管和回收管；将 PCR 产物移至脱酶管中，每管约加 200 μl，13000 r/min 离心至 Mkrocon-3 脱盐管中残液约 50 μl；弃去脱酶管和回收管，将脱盐管倒置于一个新的回收管中，1000 r/min 离心 5 min，合并回收样品。
(2) 体外转录
① 转录过程。
按下列顺序加入各反应液组分：5X T7 转录缓冲液 4 μl，rNTP 混合液 6 μl，DNA 模板 1~2 μg，T7 RNA 聚合酶 2 μl，用无 RNase 的 DEPC 水补齐至 20 μl。
整个转录体系在 37°C 反应 3~4 h，然后加入 DNA 酶置 37℃ 反应 30~60 min 以消化 DNA 模板（每 1 μg DNA 加入 1U DNA酶）；用含 7 mol/L 尿素的 8% 丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定分析及切胶冋收，在进行电泳前转录产物要在 95℃ 变性 5 min，然后再置冰浴中 5 min。
② 切胶回收 RNA。
转录 RNA 产物在 8% 尿素变性 PAGE 凝胶上电泳后，切下相应的 RNA 条带移入微量离心管中，加入 2 倍体积的 RNA 凝胶洗脱缓冲液，每 400 μl 洗脱液中加入 1 单位 RNA 酶抑制剂，用一次性移液器吸头在管内转动并压向管侧壁以挤碎凝胶片，最后封好离心管，37°C 洗脱过夜。
次日小心地将洗脱液吸至一个新的 1.5 ml 离心管中（不要将凝胶吸出），加入 2.5 倍体积的无水乙醇，1/10 体积的 3 mol/L 乙酸钠，pH 5.2，-70°C 放置 3 h，然后 4℃ 12000 r/min 离心 30 min，弃上清液，沉淀用 4℃ 预冷的 0.5~1 ml 70% 乙醇冲洗后再离心弃上清液，室温中干燥沉淀，最后将干燥好的 RNA 溶于适量的无 RNA 酶 DEPC 水中，冻存在 -20℃ 或 -70℃。
③ 确定与靶蛋白的亲和参数
可以通过滤膜法或凝胶阻滞法绘制出靶蛋白浓度与 RNA 库结合量的关系图，对蛋白浓度取对数作图时关系图通常为 S 型曲线，在较高浓度时达到一个平台期，提示为饱和结合量。自图中计算出达到饱和时所需蛋白浓度的 5%~10% 作为下面筛选实验中应用的蛋白浓度。
3. RNA 配基的筛选
分离与靶分子结合的 RNA 分子的方案有多种，包括微孔板法、硝酸纤维素滤膜法、 凝胶阻滞法 ( gel-shift )、免疫共沉淀法以及柱结合法等。微孔板法的优势是操作较为简单，但由于整个反应体系为半固相化，可能影响靶分子的天然构象；滤膜法和凝胶阻滞法 的优势是在筛选过程中即可获得富集情况的数据；免疫共沉淀法则可以用来筛选复杂的或不纯的靶分子。
(1) 微孔板法
① 筛选过程
A. 包板。在可拆卸酶标板上操作，设 A、B 两孔，B 孔用 200 μl 靶蛋白溶液（溶于 PBS，pH 7.4）包被；A 孔只加 200 μl PBS，4℃ 过夜。
B. 封闭。弃去包被上清液，200 μl/孔加入 SHMCK 封闭缓冲液，37℃ 孵育 2 h。
C. 筛选。用 200 μl/孔洗涤缓冲液洗涤 6 次，3 min/次；将变性冷却处理的 RNA 溶于 200 μl 结合缓冲液中，加入 A 孔，然后 37℃ 孵育 45 min；洗涤 B 孔；将 A 孔内的上清液移入 B 孔，37℃ 孵育 2 h，然后洗涤。（此步骤中包含了反筛过程，即去除与微孔板介质结合的随机序列的过程。）
② RT-PCR
A. 反转录过程。酶标板置于 95℃ 变性 5 min后置于 4°C 5 min，然后加入反转录反应各成分：5X AMV 缓冲液 10 μl，dNTP 混合物 5 μl，AMV 反转录酶（10 U/μl） 1 μl，3' 引物（25 pmol/μl） 5 μl，用无 RNA 酶的 DEPC 水补齐至 50 μl，于 42℃ 反复 1 h。
B. PCR 扩增。PCR 反应体系如下：10X PCR 反应缓冲液 10 μl，dNTP 混合液 8 μl，5' 引物（25 pmol/μl） 1 μl，3' 引物（25 pmol/μl） 1 μl，反转录全体系 50 μl，Taq DNA 聚合酶（2 U/μl）1 μl，加去离子水补齐至 100 μl。
PCR 反应条件：95°C 预变性 5 min 后，扩增 5 个循环，每个循环 94℃ 变性 1 min，55℃ 退火 2 min，72°C 延伸 1 min，最后再 72°C 延伸 5 mim。
C. 再进行 PCR 以确定最终扩增所需的循环数：取 10 μl 上述 PCR 产物为模板，再次进行 PCR 扩增，每 3 个循环取样做 10% PAGE 分析。选择 PCR 产量大且无杂带的循环数为最佳循环数，将剩余的 90 μl 产物全部进行 PCR 扩增。
D. 乙醇沉淀回收 PCR 扩增产物。如果有杂带则需要切胶回收正确条带（参照 RNA 切胶回收方法）。
③ 体外转录
以得到的双链 DNA 为模板进行体外转录，切胶回收 RNA 作为下一轮筛选的文库。
④ 重复筛选
以上筛选→分离→RT-PCR→体外转录等过程重复进行，共进行 n 轮筛选。
⑤ 用 RT-PCR 法对 RNA 配基进行特异性分析
在第 n 轮筛选过程中同时设筛选组和对照组，筛选组加靶蛋白，对照组不加靶蛋白。 两组都加入等量的做孵育，筛选及 RT-PCR，然后用 10% PAGE 进行鉴定分析并比较两者的结合情况。
(2) 硝酸纤维素滤膜法
① 筛选程序
A. 孵育。将纯化后的 RNA 在 100°C 变性 5 min，立即置于冰浴中 5 min；将 RNA 与靶分子在 200 μl SHMCK 缓冲液中轻轻混匀，于 37°C 共孵育 1 h，使 RNA 和靶分子充分作用。
B. 分离。接通砂芯漏斗负压装置，用 SHMCK 缓冲液冲洗砂芯漏斗；小心地将 HAWP 滤膜置于砂芯漏斗的中部，用 SHMCK 缓冲液预湿滤膜；将孵育混合液点在膜上，使用 1 ml SHMCK 缓冲液在柔和的负压下洗涤。
C. 与靶蛋白结合的 RNA 的回收。将滤膜放入 1.5 ml 离心管中，用无 RNA 酶污染的小剪刀将滤膜剪碎，加入 200 μl 滤膜洗脱液，于 100℃ 煮沸洗脱 5 min；将洗脱上清移入新的离心管中，向原管中再加入 200 μl 滤膜洗脱液重复洗脱一次，合并两次洗脱液并用； 乙醇沉淀。
②~④ 方案同微孔板法 ②~④。
(3) 凝胶阻滞法
凝胶阻滞法类似于硝酸纤维素滤膜法，只是分离方法是 PAGE 凝胶电泳法，蛋白质和相应的寡核苷酸结合而形成复合物会使寡核苷酸的分子质量及电荷发生改变，因而在 PAGE 电泳体系中的电泳迁移率发生改变，比游离寡核苷酸片段的泳动速率要慢得多，将该泳动速率慢的 RNA 经切胶回收，RT-PCR，投入下一轮筛选。
(4) 免疫共沉淀法
①筛选过程
A. 用过量的 NT2 缓冲液膨胀蛋白 A Sepharose 凝胶珠（bead）10 min；用 1 ml NT2 缓冲液洗珠子，12000 g 离心 10 s，共洗三次；珠子的量应能足够结合 2 mg 靶蛋白，并同时准备相同量的珠子用来对库进行反筛。
B. 加入适当体积的抗体，加入抗体的量决定于靶蛋白与抗体的结合能力，并有必要加入略多的抗体；在 4℃ 孵育 1 h 以使抗体结合到珠子上；再用 3X 1 ml NT2 缓冲液洗。
C. 反筛。将结合抗体的凝胶珠等分成两份，并加入等体积的 RNA 结合缓冲液，其中一份中加入 RNA 文库，于 4℃ 孵育 30 min，离心后收集上清待用。
D. 将另一份凝胶珠移至新的离心管中，加入 1~10 μg 靶蛋白对于 50 kDa 的靶蛋白来说 10 μg 已有 0.2 mmol，即使对于第一轮筛选也已足够），4°C 孵育 10 min，用 3X 1 ml NT2 缓冲液冲洗。
E. 加入步骤 C 准备的 RNA，4℃ 孵育 10 min，用 5X 1 ml NT2 缓冲液洗。
F. 在最后一次洗珠子时取 100 μl NT2 留样，加入 100 μl DEPC 水、200 μl 2X 蛋白酶 K 缓冲液、5 μl 蛋白酶，37℃ 孵育 15 min 再加入 PCI（酚：氯仿：异戊醇= 25 : 24 : 1），涡旋振荡 30 s，12000 g 离心 1 min，将上清移至一新的离心管中用乙醇沉淀。
②~④ 方案同微孔板法 ②~④。
4. 筛选后获得的特异 RNA 配基的分析
(1) 亲和力与特异性的分析，平衡解离常数 Kd 的测定
① 放射性同位素标记 RNA
体外转录总体系为 20 μl：5X T7 转录缓冲液 4 μl，25 mmol/L ATP，CTP，GTP 各 1.5 μl，25 mmol/L UTP 0.15 μl，[ α-32P ] UTP（3000 Ci/mmol）2.5 μl，DNA 模板 1~2 μg，T7 RNA 聚合酶 2 μl，用无 RNase 的 DEPC 水补齐至 20 μl。
其余反应过程与转录过程相同。转录产物经尿素变性胶电泳后进行切胶回收，然后进行放射性强度检测：取 1 μl 回收溶解的 α-32P 标记 RNA 用 99 μl DEPC 水稀释后点在膜上，放于自炽灯下烘烤干，将膜夹入液闪瓶中，加入 3 ml 闪烁液，在液闪仪中计数。
② Kd 的测定
A. 滤膜法。将 5~10 pmol α-32P 标记的 RNA（约 80000 cpm）变性冷却处理后与不同浓度的蛋白质在 20 μl SHMCK 缓冲液中混合，于 37℃ 孵育 30 min；HAWP 膜预先用 SHMCK 缓冲液浸湿，用干烤过的小镊子将膜放置于 Millipore 小滤器上；将样品小心地点在膜的中央，将滤器的盖子拧紧；用一次性的 5 ml 注射器吸取 SHMCK 缓冲液加压冲冼滤膜；将滤膜取出，烤干，置于闪烁杯中，加入闪烁液，测定 cpm 值并用 Origin 4.0 作图分析测定解离常数值。平衡解离常数 Kd 用来表示 RNA 与靶蛋白结合的强弱情况，Kd =[ RNA ] X [ 靶蛋白 ] / [ RNA 靶蛋白复合体 ]，当靶蛋白浓度远大于 RNA 的浓度时 Kd 值近似等于 RNA 结合量为最大量的一半时的蛋白浓度，通常在 nmol/L 水平。
B. 凝胶阻滞法。该方法类似于滤膜法，仅用 PAGE 胶分离结合与游离的 RNA，然后进行放射自显影。
(2) 克隆测序
将经过适当几轮筛选后的 RNA 配基子群体进行 RP-PCR，然后切胶回收；回收 DNA 片段与 pGEM-T 载体连接，转化感受态细菌。挑取适当数目的克隆经 PCR 鉴定，有正确大小的条带的克隆进一步进行序列鉴定，一般有 20 个克隆以上。
(3) 序列和生物学活性分析
对这些序列进行 RNA 的二级结构预测（可用 RNAstructure 或在线工具 Mfold http：//hininfo.match.rpi.edu/~Mfold/rna/forml.cgi）并分析其中随机区域的保守性 。挑选出最有代表性的序列并进一步测定其平衡解离常数以获得亲和力最高的 RNA 配基。
根据靶分子的生物学功能，可以分析获得的 RNA 配基的生物学活性。
(4) 进一步的应用
对这些 RNA 配基还可以进行改造，例如去除两端的同定序列等，以进一步分析 RNA 配基与靶蛋白的相互作用。
对寡核苷酸配基进行修饰，修饰的目的有两个：一是进一步提高配基与靶蛋白相互作用的特异性；二是提高配基的生物利用度。一般情况下，寡核苷酸在体内的半衰期很短，要将配基用于临床诊断和疾病治疗就必须对其进行修饰。修饰的方式有两种：一种是在筛选前将修饰性核苷三磷酸掺入寡核苷酸库，常用的修饰位置是磷酸基团、嘧啶环的 5' 位、嘌呤环的 8' 位以及五碳糖的 2' 位。另外一种修饰是在筛选出的寡核苷酸配基上进行上述修饰。为了延长配基在体内的存留时间，可以在配基的某些位置上连接聚乙二醇，或者将配基结合在脂质体的膜囊表面。经过上述改造以后的寡核苷酸配基基本上能够满足临床要求。
1. 仪器设备：电泳仪，PCR 仪，离心机，凝胶成像仪，液体闪烁仪，长波紫外灯，紫外分光光度计，核酸定暈仪，pH计，培养箱，振荡器，洁净工作台。
2. 材料：X 线胶片（X-Omat blue Kodak 公司），可拆卸酶联板（丹麦 NUNC 公司），HAWP 膜（13 mm，0.45 μm，Millipore 公司），蛋白 A sepharose 凝胶（HiTRAP 公司），（Millipore 公司），micropure-EZ 脱酶管和 microcon-脱盐管。
3. pGKM-T 载体，RiboMAXTM 大体积转录试剂盒，AMV 反转录酶，T4 DNA 连接酶（Promega 公司）。
4. pfu Taq DNA 聚合酶，r Taq DNA 聚合酶（TaKaRa 公司）。
5. dNTP 混合液：25 nmol/L dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP 每种均为 25 nmol/L）。
6. rNTP 混合液：25 nmol/L rNTP（ATP、CTP、GTP、TTP 每种均为 25 nmol/L）。
7. DNA 凝胶洗脱缓冲液：0.5 mol/L NH4Ac，10 mmol/L MgAc2，0.1% SDS，1 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
8. RNA 凝胶洗脱缓冲液：0.2% SDS，0.5 mol/L NH4Ac，1 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
9. SHMCK 缓冲液：20 mmol/L HEPES（pH 7.35），120 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2。
10. 封闭液：SHMCK 缓冲液 + 0.1% 明胶。
11. 洗涤及洗脱缓冲液：SHMCK 缓冲液+ 0.1% 明胶 + 0.05% Tween-20。
12. 滤膜洗脱液：7 mol/L 尿素，0.5 mol/L NH4Ac，0.2% SDS，1 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
13. NT2 缓冲液：50 mmol/L Tris-HCI （pH 7.4），150 mmol/L NaCl，1 mmoI/L MgCl2，0.05% NP-40。
14. RNA 结合缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），100 mmol/L NaCl，4 mmol/L EDTA，2 mmoI/L MgCl2，0.05% NP 40，0.4% 核苷氧钒复合物（Vanadyl ribomicleoside complex），200 U/ml RNasin，100 μg/ml poly A，100 μg/ml tRNA，50 μg/ml BSA。
15. 2X 蛋白酶 K 缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.8），10 mmol/L EDTA，1% SDS。
二、操作方法
1. 随机 RNA 文库的构建及引物合成
设计一个包含 25 个随机序列，全长 85 个碱基的随机 RNA 文库，此文库两端为固定序列。可设计引物对文库进行 PCR 扩增。根据这一设计，首先要合成随机文库的 ssDNA 模板及其两条引物。
模板和引物序列如下：
5' 引物：5'-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC-3'；
3' 引物：3'-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3'；
ssDNA-G 模板：5'-TAATACGACTCACTATAGCATGGTACGGTACTTCC（25N）CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'；
其中 N 代表随机碱基，下划线部分为 T7 启动子序列，用于转录制备随机 RNA 文库。
2. 起始 RNA 文库的建立
(1) PCR 扩增 ssDNA 模板为 dsDNA
PCR 反应体系如下：10X PCR 反应缓冲液 10 μl，dNTP 混合液 8 μl，5' 引物（25 pmol/μl） 2 μl，3' 引物（25 pmol/μl） 2 μl，ssDNA 模板 0.25 μg，pfu Taq DNA 聚合酶 1 μl，加去离子水补齐至 100 μl。
PCR 反应条件：95℃ 预变性 5 min，4℃ 变性 1 min，37℃ 退火 2 min，72°C 延伸 2 min，扩增 3 个循环，最后 72℃ 终延伸 5 min。
将合成的至少 2OD260 的 ssDNA 模板全部按优化好的条件进行 PCR 以后，用超滤法浓缩纯化 PCR 产物，其操作步骤如下：按从上到下的顺序安装 Micmpure-EZ 脱酶管、Microcon-3 脱盐管和回收管；将 PCR 产物移至脱酶管中，每管约加 200 μl，13000 r/min 离心至 Mkrocon-3 脱盐管中残液约 50 μl；弃去脱酶管和回收管，将脱盐管倒置于一个新的回收管中，1000 r/min 离心 5 min，合并回收样品。
(2) 体外转录
① 转录过程。
按下列顺序加入各反应液组分：5X T7 转录缓冲液 4 μl，rNTP 混合液 6 μl，DNA 模板 1~2 μg，T7 RNA 聚合酶 2 μl，用无 RNase 的 DEPC 水补齐至 20 μl。
整个转录体系在 37°C 反应 3~4 h，然后加入 DNA 酶置 37℃ 反应 30~60 min 以消化 DNA 模板（每 1 μg DNA 加入 1U DNA酶）；用含 7 mol/L 尿素的 8% 丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定分析及切胶冋收，在进行电泳前转录产物要在 95℃ 变性 5 min，然后再置冰浴中 5 min。
② 切胶回收 RNA。
转录 RNA 产物在 8% 尿素变性 PAGE 凝胶上电泳后，切下相应的 RNA 条带移入微量离心管中，加入 2 倍体积的 RNA 凝胶洗脱缓冲液，每 400 μl 洗脱液中加入 1 单位 RNA 酶抑制剂，用一次性移液器吸头在管内转动并压向管侧壁以挤碎凝胶片，最后封好离心管，37°C 洗脱过夜。
次日小心地将洗脱液吸至一个新的 1.5 ml 离心管中（不要将凝胶吸出），加入 2.5 倍体积的无水乙醇，1/10 体积的 3 mol/L 乙酸钠，pH 5.2，-70°C 放置 3 h，然后 4℃ 12000 r/min 离心 30 min，弃上清液，沉淀用 4℃ 预冷的 0.5~1 ml 70% 乙醇冲洗后再离心弃上清液，室温中干燥沉淀，最后将干燥好的 RNA 溶于适量的无 RNA 酶 DEPC 水中，冻存在 -20℃ 或 -70℃。
③ 确定与靶蛋白的亲和参数
可以通过滤膜法或凝胶阻滞法绘制出靶蛋白浓度与 RNA 库结合量的关系图，对蛋白浓度取对数作图时关系图通常为 S 型曲线，在较高浓度时达到一个平台期，提示为饱和结合量。自图中计算出达到饱和时所需蛋白浓度的 5%~10% 作为下面筛选实验中应用的蛋白浓度。
3. RNA 配基的筛选
分离与靶分子结合的 RNA 分子的方案有多种，包括微孔板法、硝酸纤维素滤膜法、 凝胶阻滞法 ( gel-shift )、免疫共沉淀法以及柱结合法等。微孔板法的优势是操作较为简单，但由于整个反应体系为半固相化，可能影响靶分子的天然构象；滤膜法和凝胶阻滞法 的优势是在筛选过程中即可获得富集情况的数据；免疫共沉淀法则可以用来筛选复杂的或不纯的靶分子。
(1) 微孔板法
① 筛选过程
A. 包板。在可拆卸酶标板上操作，设 A、B 两孔，B 孔用 200 μl 靶蛋白溶液（溶于 PBS，pH 7.4）包被；A 孔只加 200 μl PBS，4℃ 过夜。
B. 封闭。弃去包被上清液，200 μl/孔加入 SHMCK 封闭缓冲液，37℃ 孵育 2 h。
C. 筛选。用 200 μl/孔洗涤缓冲液洗涤 6 次，3 min/次；将变性冷却处理的 RNA 溶于 200 μl 结合缓冲液中，加入 A 孔，然后 37℃ 孵育 45 min；洗涤 B 孔；将 A 孔内的上清液移入 B 孔，37℃ 孵育 2 h，然后洗涤。（此步骤中包含了反筛过程，即去除与微孔板介质结合的随机序列的过程。）
② RT-PCR
A. 反转录过程。酶标板置于 95℃ 变性 5 min后置于 4°C 5 min，然后加入反转录反应各成分：5X AMV 缓冲液 10 μl，dNTP 混合物 5 μl，AMV 反转录酶（10 U/μl） 1 μl，3' 引物（25 pmol/μl） 5 μl，用无 RNA 酶的 DEPC 水补齐至 50 μl，于 42℃ 反复 1 h。
B. PCR 扩增。PCR 反应体系如下：10X PCR 反应缓冲液 10 μl，dNTP 混合液 8 μl，5' 引物（25 pmol/μl） 1 μl，3' 引物（25 pmol/μl） 1 μl，反转录全体系 50 μl，Taq DNA 聚合酶（2 U/μl）1 μl，加去离子水补齐至 100 μl。
PCR 反应条件：95°C 预变性 5 min 后，扩增 5 个循环，每个循环 94℃ 变性 1 min，55℃ 退火 2 min，72°C 延伸 1 min，最后再 72°C 延伸 5 mim。
C. 再进行 PCR 以确定最终扩增所需的循环数：取 10 μl 上述 PCR 产物为模板，再次进行 PCR 扩增，每 3 个循环取样做 10% PAGE 分析。选择 PCR 产量大且无杂带的循环数为最佳循环数，将剩余的 90 μl 产物全部进行 PCR 扩增。
D. 乙醇沉淀回收 PCR 扩增产物。如果有杂带则需要切胶回收正确条带（参照 RNA 切胶回收方法）。
③ 体外转录
以得到的双链 DNA 为模板进行体外转录，切胶回收 RNA 作为下一轮筛选的文库。
④ 重复筛选
以上筛选→分离→RT-PCR→体外转录等过程重复进行，共进行 n 轮筛选。
⑤ 用 RT-PCR 法对 RNA 配基进行特异性分析
在第 n 轮筛选过程中同时设筛选组和对照组，筛选组加靶蛋白，对照组不加靶蛋白。 两组都加入等量的做孵育，筛选及 RT-PCR，然后用 10% PAGE 进行鉴定分析并比较两者的结合情况。
(2) 硝酸纤维素滤膜法
① 筛选程序
A. 孵育。将纯化后的 RNA 在 100°C 变性 5 min，立即置于冰浴中 5 min；将 RNA 与靶分子在 200 μl SHMCK 缓冲液中轻轻混匀，于 37°C 共孵育 1 h，使 RNA 和靶分子充分作用。
B. 分离。接通砂芯漏斗负压装置，用 SHMCK 缓冲液冲洗砂芯漏斗；小心地将 HAWP 滤膜置于砂芯漏斗的中部，用 SHMCK 缓冲液预湿滤膜；将孵育混合液点在膜上，使用 1 ml SHMCK 缓冲液在柔和的负压下洗涤。
C. 与靶蛋白结合的 RNA 的回收。将滤膜放入 1.5 ml 离心管中，用无 RNA 酶污染的小剪刀将滤膜剪碎，加入 200 μl 滤膜洗脱液，于 100℃ 煮沸洗脱 5 min；将洗脱上清移入新的离心管中，向原管中再加入 200 μl 滤膜洗脱液重复洗脱一次，合并两次洗脱液并用； 乙醇沉淀。
②~④ 方案同微孔板法 ②~④。
(3) 凝胶阻滞法
凝胶阻滞法类似于硝酸纤维素滤膜法，只是分离方法是 PAGE 凝胶电泳法，蛋白质和相应的寡核苷酸结合而形成复合物会使寡核苷酸的分子质量及电荷发生改变，因而在 PAGE 电泳体系中的电泳迁移率发生改变，比游离寡核苷酸片段的泳动速率要慢得多，将该泳动速率慢的 RNA 经切胶回收，RT-PCR，投入下一轮筛选。
(4) 免疫共沉淀法
①筛选过程
A. 用过量的 NT2 缓冲液膨胀蛋白 A Sepharose 凝胶珠（bead）10 min；用 1 ml NT2 缓冲液洗珠子，12000 g 离心 10 s，共洗三次；珠子的量应能足够结合 2 mg 靶蛋白，并同时准备相同量的珠子用来对库进行反筛。
B. 加入适当体积的抗体，加入抗体的量决定于靶蛋白与抗体的结合能力，并有必要加入略多的抗体；在 4℃ 孵育 1 h 以使抗体结合到珠子上；再用 3X 1 ml NT2 缓冲液洗。
C. 反筛。将结合抗体的凝胶珠等分成两份，并加入等体积的 RNA 结合缓冲液，其中一份中加入 RNA 文库，于 4℃ 孵育 30 min，离心后收集上清待用。
D. 将另一份凝胶珠移至新的离心管中，加入 1~10 μg 靶蛋白对于 50 kDa 的靶蛋白来说 10 μg 已有 0.2 mmol，即使对于第一轮筛选也已足够），4°C 孵育 10 min，用 3X 1 ml NT2 缓冲液冲洗。
E. 加入步骤 C 准备的 RNA，4℃ 孵育 10 min，用 5X 1 ml NT2 缓冲液洗。
F. 在最后一次洗珠子时取 100 μl NT2 留样，加入 100 μl DEPC 水、200 μl 2X 蛋白酶 K 缓冲液、5 μl 蛋白酶，37℃ 孵育 15 min 再加入 PCI（酚：氯仿：异戊醇= 25 : 24 : 1），涡旋振荡 30 s，12000 g 离心 1 min，将上清移至一新的离心管中用乙醇沉淀。
②~④ 方案同微孔板法 ②~④。
4. 筛选后获得的特异 RNA 配基的分析
(1) 亲和力与特异性的分析，平衡解离常数 Kd 的测定
① 放射性同位素标记 RNA
体外转录总体系为 20 μl：5X T7 转录缓冲液 4 μl，25 mmol/L ATP，CTP，GTP 各 1.5 μl，25 mmol/L UTP 0.15 μl，[ α-32P ] UTP（3000 Ci/mmol）2.5 μl，DNA 模板 1~2 μg，T7 RNA 聚合酶 2 μl，用无 RNase 的 DEPC 水补齐至 20 μl。
其余反应过程与转录过程相同。转录产物经尿素变性胶电泳后进行切胶回收，然后进行放射性强度检测：取 1 μl 回收溶解的 α-32P 标记 RNA 用 99 μl DEPC 水稀释后点在膜上，放于自炽灯下烘烤干，将膜夹入液闪瓶中，加入 3 ml 闪烁液，在液闪仪中计数。
② Kd 的测定
A. 滤膜法。将 5~10 pmol α-32P 标记的 RNA（约 80000 cpm）变性冷却处理后与不同浓度的蛋白质在 20 μl SHMCK 缓冲液中混合，于 37℃ 孵育 30 min；HAWP 膜预先用 SHMCK 缓冲液浸湿，用干烤过的小镊子将膜放置于 Millipore 小滤器上；将样品小心地点在膜的中央，将滤器的盖子拧紧；用一次性的 5 ml 注射器吸取 SHMCK 缓冲液加压冲冼滤膜；将滤膜取出，烤干，置于闪烁杯中，加入闪烁液，测定 cpm 值并用 Origin 4.0 作图分析测定解离常数值。平衡解离常数 Kd 用来表示 RNA 与靶蛋白结合的强弱情况，Kd =[ RNA ] X [ 靶蛋白 ] / [ RNA 靶蛋白复合体 ]，当靶蛋白浓度远大于 RNA 的浓度时 Kd 值近似等于 RNA 结合量为最大量的一半时的蛋白浓度，通常在 nmol/L 水平。
B. 凝胶阻滞法。该方法类似于滤膜法，仅用 PAGE 胶分离结合与游离的 RNA，然后进行放射自显影。
(2) 克隆测序
将经过适当几轮筛选后的 RNA 配基子群体进行 RP-PCR，然后切胶回收；回收 DNA 片段与 pGEM-T 载体连接，转化感受态细菌。挑取适当数目的克隆经 PCR 鉴定，有正确大小的条带的克隆进一步进行序列鉴定，一般有 20 个克隆以上。
(3) 序列和生物学活性分析
对这些序列进行 RNA 的二级结构预测（可用 RNAstructure 或在线工具 Mfold http：//hininfo.match.rpi.edu/~Mfold/rna/forml.cgi）并分析其中随机区域的保守性 。挑选出最有代表性的序列并进一步测定其平衡解离常数以获得亲和力最高的 RNA 配基。
根据靶分子的生物学功能，可以分析获得的 RNA 配基的生物学活性。
(4) 进一步的应用
对这些 RNA 配基还可以进行改造，例如去除两端的同定序列等，以进一步分析 RNA 配基与靶蛋白的相互作用。
对寡核苷酸配基进行修饰，修饰的目的有两个：一是进一步提高配基与靶蛋白相互作用的特异性；二是提高配基的生物利用度。一般情况下，寡核苷酸在体内的半衰期很短，要将配基用于临床诊断和疾病治疗就必须对其进行修饰。修饰的方式有两种：一种是在筛选前将修饰性核苷三磷酸掺入寡核苷酸库，常用的修饰位置是磷酸基团、嘧啶环的 5' 位、嘌呤环的 8' 位以及五碳糖的 2' 位。另外一种修饰是在筛选出的寡核苷酸配基上进行上述修饰。为了延长配基在体内的存留时间，可以在配基的某些位置上连接聚乙二醇，或者将配基结合在脂质体的膜囊表面。经过上述改造以后的寡核苷酸配基基本上能够满足临床要求。
注意事项
防止RNA酶的污染。
常见问题
一、 防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1％ DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3％ H2O2 室温10min，然后用0.1％ DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1％ DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
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