卵和胚胎细胞总RNA提取

Triton X-100 匀浆缓冲液 酚 氯仿 乙酸钠 乙醇 氯化锂

一 材料与设备

1)5%TritonX-100

2) 匀浆缓冲液：50 mmol/LNaCl,50 mmol/LTris-Cl,(PH7.5),5 mmol/LEDTA(pH8.0),0.5%SDS,200ug/ml 蛋甶酶 K

3) 酚：氯仿 (1:1)

4)3mol/L 乙酸钠 (pH5.2)。

5) 乙醇

6)8mol/L 氯化锂


二 操作方法

1) 将待处理的组织放置下一个干烤过的玻璃匀浆器内，弃去无关的液体，用 0.5% TriwnX-100 洗涤蝇胚，以去除培养基。

2) 加 10 倍体积的匀浆缓冲液、立即研磨使组织彻底匀浆化。

3) 于 37℃ 将组织匀浆温育 l h, 间或混匀之。

4）将匀浆移至离心管内，加等体积酚：氯仿（1:1)，剧烈振荡 1 min，用吊桶式转头于室温以 5000 g 离心 l0mim, 使水相和有机相分开。

5) 将上层水相移至另一离心管内. 按步骤 4 用酚：氯仿（1:1) 再抽提 1 次。

6) 将水相移至为-管内，加 0.1 体积 3mol/L 乙酸钠 (PH5.2)，混匀，加 2.5 倍体积冰预冷的乙醇，冰浴 2 h

7) 于 4°C 以 5000 g 离心 l5 min，小心去除上淸液，室温晾下 RNA 沉淀. 少量水溶解RNA, 加 3 倍体积乙酔，于—70℃ 储存备用.如要除去糖蛋白和卵黄物质，则可根据需要逬行步骤 8)〜11)

8) 用少量水重溶 RNA 沉淀，加等体积经髙压灭菌的 8mol/L 氯化锂，混匀，一 20℃放置 3 h 以上。

9) 于 4℃ 以 10000 g 离心 30 min 沉淀 RNA, 小心弃上清。

10) 用 70% 乙醇洗涤沉淀，离心片刻，弃去上清液. 于空气中晾干核酸沉淀。

11) 用少量水重溶 RNA, 加 3 倍体积乙醇，于 一 70℃ 储存备用。

1) 用氯化锂沉淀 RNA 从而有助于去除糖蛋白和卵黄物质

2) 由于此方法分离的 RNA 量大超过污染的 DNA 量，因此不必除去制品中的 DNA。尽管污染的基因组 DNA 序列不干扰杂交和翻译，但如果此 RNA 用于构建 cDNA 文库，则这些 DNA 可能会引起混乱，在这种情况下吋用无 RNA 酶的胰 DNaseI 进行消化，以去除污染的 DNA