探针的标记

在RNA原位杂交中，不仅要选择适当的探针，而且还要使探针得到有效的标记。探针标记法有酶反应法和化学反应法。

1. 酶反应法：用于RNA探针的酶反应法主要为末端标记法与体外转录法。末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的5'端或3'端的一种标记法，末端标记适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。

2. 体外转录法：体外转录法是一种制备与克隆片段序列相同的单链RNA探针的方法。进行体外转录时，先将靶核苷酸序列克隆到含噬菌体转录启动子的载体中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA为模板，以含有标记的三磷酸苷为原料，对启动子下游的序列进行转录，而启动子本身并不被转录。

体外转录常用噬菌体转录启动子，如沙门氏菌噬菌体和大肠杆菌噬菌体T3，T7。当两个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多克隆位点的两侧，用适当的限制性内切酶在插入序列的下游将质粒线性化。SP6噬菌体的RNA聚合酶对SP6启动子序列具有高度的亲和性，从而启动下游的转录，在4种三磷酸核糖核苷和相应的噬菌体RNA聚合酶存在的条件下，即转录成RNA。如反应物中含有标记的三磷酸核糖核苷，所有的RNA就被标记。

依标记物为同位素和非同位素，近年来非同位素标记探针已有了极大的近步。常用非同位素标记技术有生物素，地高辛，碱性磷酸酶，辣根过氧化酶和荧光素。非同位素标记法又可分为直接标记法和间接标记法。直接标记法是将标记物直接结合到探针上，当探针与组织内相应靶核苷酸结合后，即可显色观察。

这类标记探针必须符合标记物在杂交过程中不丢失，又不影响杂交反应为条件。大量已发表的文献表明，由于检出杂交信号受到多种因素制抑，只能限于靶RNA丰富的细胞或组织中，RNA杂交对低拷贝的基因检测不理想。近年来间接标记法得到较快发展，先将标记物结合在探针上，通过特异性抗体识别，由特异性抗体结合多种酶，对检测的杂交信号作有放大，这一类标记法已展示极好的发展前景。