重组载体的构建及鉴定

重组载体的构建及鉴定

引言：根据实验目的，设计需要重组目的基因或RNAi片段，通过生物合成公司合成，需要说明的是设计的每条单链DNA其两端都应有没切位点，以便于重组。

1. 合成 的 ssDNA ，分别命名：编码链为 Forward ssDNA , 模板链为 Reverse ssDNA ， 每1 OD ssDNA 各加33 μl 无菌去离子水溶解，分别取18 μl 进行退火。

在1.5ml Eppendorf管中依次加入以下试剂

10× PCR buffer 4μl

Forward ssDNA 18μl

Reverse ssDNA 18μl

总体积 40μl

混匀，离心集中样品。 90 ℃ 5min ,缓慢冷却至室温。

2. dsDNA 的双酶切

dsDNA 的 Hind Ⅲ 和 BamH Ⅰ双酶切

1.5ml Eppendorf 管中依次加入以下试剂

10×Tango buffe r 10μl

酶1 1 μl

酶2 1 μl

dsDNA 20μl

无菌去离子水 17μl

总体积 50μl

（注意： buffe r 的选择要根据你所用的酶1，2来确定，如下表：

B+(BLUE) G+(GREEN) O+(ORANGE ) R+(RDE) BUFFER Y+ 1X TANGO

2X  

BamH1 20-50* 100 20-50 50-100* 100* 50-100  

Hind Ⅲ 0-20 20-50 0-20 0-20 50-100 50-100  

BamH1，Hind Ⅲ 在 2XTANGO中活性比其他几种BUFFER中要高，因此我们如果要用BamH1，Hind Ⅲ 做双酶切的话，首选的BUFFER是 TANGO，下面的双酶切中BUFFER 选择也是一样的 ）。

混匀，离心集中样品。 37 ℃ 温育过夜，次日，酚氯仿抽提一次， -20 ℃ 无水乙醇沉淀过夜。再次日， 4 ℃ 10000rp m 离心 10min 。 沉淀用 70 ﹪的酒精洗涤一次， 37 ℃ 烘干，加 200μl 无菌去离子水溶解。

3 质粒载体 的双酶切。

1.5ml Eppendorf 管中依次加入以下试剂

R buffer 5μl

酶1 1 μl

酶 Ⅱ 1μl

空质粒 5μl

无菌去离子水 38. 5 μl

总体积 50μl

混匀，离心集中样品。37 ℃ 温育4h，取10 μl 进行1.0 ﹪ 的琼脂糖凝胶电泳。

4 pSUPER.basic 双酶切后大片段凝胶回收

使用BioDev北京博大泰克得 B 型小量 DNA 片段快速胶回收试剂盒，按说明书的步骤回收大片段。

5 双酶切后的 空载体 与 dsDNA 连接。

连接体系如下：

1.5ml Eppendorf 管中依次加入以下试剂

T4 Ligase buffer 1 μl

T4 ligase 1 μl

dsDNA 1 μl

空质粒 4 μl

无菌去离子水 3 μl

总体积 10 μl

混匀，离心集中样品，16 ℃ 连接过夜。

6 连接产物的转化

5lu双酶切dsDNA加入到100ul 感受态细胞（JM109），冰浴30min，42 0 热休克90s，加入400ul无抗的LB ，37 0 ，150rpm，1h，涂平板。37 0

过夜。

7 质粒提取。

8 PCR鉴定。

注：这些都是我们的工作经验总结，多少次失败后的成功经验，也有好多PCR,双酶切的图片，可惜没有办法上传，如果有什么问题，我们可以交流，QQ27793402，邮箱：yangyang_won@163.com  

(责任编辑：大汉昆仑王)