技术贴 | 教你做斑马鱼的纳米药物功能和毒性评价实验

纳米技术的最终目的是使人类能够按照自己的意志操纵单个原子，在 0.1-100nm 空间尺度内制造具有特定功能的产品，实现生产方式的飞跃。纳米技术在临床中的应用是我们关注的焦点之一。然而，虽然纳米药物的研发如火如荼，但能真正上市的品种为数不多，而且几乎都集中在癌症治疗领域。造成这种情况的原因之一就是纳米技术可能会造成不确定的生物学后果。

这篇文章将着重突出斑马鱼模型的特点和用途，希望此文能够对不熟悉斑马鱼的研究人员起到一定的指引作用。本文将从斑马鱼特性开始、针对一些特别的模型展开筛选、药效评价和安全性评价的实验介绍，希望能在纳米级交付系统开发中与复杂的临床前筛查进行轻松地整合。

首先，我们通过一些直观地图片来介绍一下斑马鱼的优势。

斑马鱼转基因模型地应用

就像上图看到得那样，斑马鱼这个模式生物拥有很多转基因模型，而这些转基因模型主要被应用在这些领域：1. 血管生成和抗癌药物筛选；2. 器官荧光和器官特异性药物。因为斑马鱼身体的透明性，我们可以很清楚地观察到血管和纳米药物输送系统的分布和功能，因此在肿瘤领域尤其是血管新生领域应用广泛，尤其是你觉得染色太麻烦的时候。

▲杭州环特生物科技股份有限公司部分转基因鱼（包括且不限于血管荧光（绿色）、（红色）；中性粒细胞荧光；运动神经荧光；颅神经荧光；巨噬细胞荧光；软骨荧光（绿色）；心脏荧光斑马鱼（绿色））

而具有荧光器官的斑马鱼的转基因模型可用于跟踪标记的纳米级药物递送系统或用于测试其器官功效。例如，Tg（BMP4：EGFP）是具有绿色荧光心肌的模型，已被用于普通心脏和心脏毒性药物（肾上腺素，多沙唑嗪，艾司洛尔和多柔比星）的功能筛选。

使用更先进的成像工具，还可以使用跳动斑马鱼心脏的假动力学 3D 图像来分析药物递送后心脏功能的变化。同样，可以使用斑马鱼的各种器官模型，例如具有荧光肝、脑、胰腺的器官模型来监测对不同纳米材料的器官特异性反应。

在癌症领域的独特价值

常规有以下几种制作斑马鱼肿瘤模型的方法，如化学处理、转基因技术和异种移植等。暴露于二甲基苯并蒽可诱导肠癌，Myc 基因的过表达会导致斑马鱼中的 T 细胞白血病，与其他两种方法相比，异种移植可以产生更多种类型的癌症（见下表）。

其中，用 Qtracker 红标记的人 B16-F10 黑素瘤细胞的移植已被用于模拟斑马鱼胚胎中的人黑素瘤。注射纳米级药物递送系统后，可以监测具有荧光标记物的异种移植物。研究人员可以通过计数循环肿瘤细胞的数量，在异种移植的斑马鱼模型中成像中了解到转移。使用 flk1：mCherry 观察移植的 GFP 标记的 BRAF V600E 异种移植物及其周围血管形成的生长等。此外，肿瘤异质性可以通过分化状态的不同通过不同荧光标记物标记来区分肿瘤细胞。

用斑马鱼模型进行纳米药物递送系统的毒性筛选

任何新的药物输送系统如果不安全，那么都是没有用的。因此，许多成功获得资助的纳米药物递送系统的开发过程中，通常包括用小鼠模型进行的毒性筛选。然而，小鼠模型的临床前研究可能非常耗时，而且对于大多数研究实验室来说也是昂贵的。通过斑马鱼模型进行毒性筛选，我们可以促进更安全的生物安全的纳米药物输送系统的诞生。

斑马鱼是研究毒性筛选的理想模型，因为斑马鱼胚胎可以模仿复杂的体内相互作用，而且与人类基因组和生物系统具有高度的同源性。斑马鱼胚胎还可以在暴露于纳米材料时，对表型和基因型异常进行监测，观察发育过程中器官大小和形状的变化是生物毒性判断简单而有价值的指标。而斑马鱼技术低成本、发育快速和易于处理的特性，可快速高产量和具有成本效益的临床前筛查。

斑马鱼胚胎的死亡率和孵化率是生物毒性最常见且最方便的监测指标，两个指标一般都在 72 hpf 时测量。较轻的毒性作用通常通过心脏缺陷来反映，也可以通过监测心率来评估。当心脏完全发育时，建议在 48、72 和 96 hpf 时计数心跳 30 秒，另外还可以在 96 hpf 后以 24 h 为间隔监测肝脏纳米材料的积累部位。

结语

纳米材料的功能和毒理学筛选对于成功开发纳米药物递送系统至关重要，特别是当纳米医药的安全性不断受到质疑时。然而，许多相关研究没有包括临床前的动物模型研究，因为它们通常花费相当的劳动力、金钱和时间。

斑马鱼是一种有很大应用价值的替代动物模型，错误地被认为与人类的同源性差。然而，如上所述，斑马鱼与人类分享大多数疾病基因和生物系统。此外，斑马鱼模型的优点使其成为纳米医学研究的多功能动物模型。

最后，斑马鱼研究的实验条件在不同的实验间变化较大，使得不同实验室间的比较和基准测试几乎是不可能的。因此，我们也希望为那些想在研究中采用斑马鱼模型的人提供了一个指导方针，进而在将来可以建立一个斑马鱼基准，以加速纳米药物输送系统的临床应用。