层析技术（色谱法或色层法）

层析法又称色谱法或色层法，开始由分离植物色素而得名，后来不仅用于分离有色物质，而且在多数情况是用于分离无色物质。层析法是近代 生物 化学最常用的分析方法之一，此种方法可以分离和鉴定性质极为相似，而且用一般化学方法难以分离的多种化合物，如氨基酸、蛋白质、糖、脂类、核苷酸、核酸等。 一、层析的基本原理 　　层析法是利用混合物各组分物理化学性质（溶解度、吸附能力、电荷、分子大小与形状及分子亲和力等）的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相即流过此固定相的液体或气体称流动相，从而使各组分以不同的速度随流动相向前移动而达到分离的目的。 　　在层析过程中，溶质在固定相和流动相中差速迁移，它既可进入固定相，又可进入流动相，这个过程叫分配过程，不论层析机理属于哪一种，分配过程都存在。分配过程进行的速度，可用分配系数  K  表示： K  ＝  　　比值  K  在低浓度时是个常数，只受温度影响。不同的层析机理，  K  的含义不同。在吸附层析中， K 为吸附平衡常数；在分配层析中，  K  为分配系数；在离子交换层析中，  K  为交换常数；在亲和层析中，  K  为亲和系数。 　　混合物中各组分的分配系数往往是不同的，即保留在固定相中的特性是不同的。常用保留时间，即被分析样品从进样开始到流出液中出现浓度极大点的时间；或保留体积，即被分析样品从进样开始到流出液中出现浓度极大点时，所通过流动相的体积来衡量。 　　分配系数  K  值大，说明该物质在柱中被吸附得牢，移动速度慢，在固定相中停留的时间长，将最后出现在洗脱液中亦既保留体积大，保留时间长。反之，如  K  值小，即这种物质在柱中被吸附得弱，移动速度快，将首先出现在洗脱液中。亦既保留体积小，保留时间短。可见混合物中各组分之间分配系数  K  值相差愈大，各物质愈容易彼此分开。如果  K  ＝ 0, 就意味这溶质不能进入固定相，而始终保留在流动相里，并随着流动相迅速的流出。显然，这种固定相和流动相体系是不能实现分离的。因此，应当根据被分离物质的化学结构和性质（极性）适当的选择固定相和流动相，并且使各组分的分配系数尽可能大一些，就可以使混合物中各组分分离完全。 二、层析的分类 （一）按层析两相所处的状态分类 　　流动相有液体和气体两种状态。液体作为流动相，称为液相层析；气体作为流动相，称为气相层析。固定相有液体和固体两种状态，即以固体吸附剂作为固定相和以附载在固体上的液体作为固定相。所以，层析法按两相所处的状态可以分为： 　　1 ．液相层析 （ 1 ）液 — 固层析 液体作为流动相，固体吸附剂作为固定相。 （ 2 ）液 — 液层析 液体作为流动相，附载在固体上的液体作为固定相。 　　 2 ．气相层析 （ 1 ）气 — 固层析 气体作为流动相，固体吸附剂作为固定相。 （ 2 ）气 — 液层析 气体作为流动相，附载在固体上的液体作为固定相。 （二）按层析过程的机制分类 　　1 ．分配层析 　　利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数（或溶解度）不同，而使之分离的技术。 　　2 ．吸附层析 　　利用不同组分被吸附剂表面吸附性能的差异，而使之分离的技术。 　　3 ．离子交换层析 　　利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同，而进行分离的技术。 　　4 ．凝胶层析 　　利用某些凝胶对不同组分因其分子大小不同而阻滞作用不同的差异，而进行分离的技术。 　　5 ．亲和层析 　　利用某些 生物 高分子能与相应的配体专一可逆结合的机理，而进行分离纯化高分子的技术。