在质粒载体中进行平末端片段的克隆

1、分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化1－10μg质粒DNA和外源DNA片段，使它们能产生平末端。

2、苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源DNA片段。

3、分别用TE（pH 8.0）重新溶解纯化出的两种DNA沉淀，使终浓度为100 ng/ml。假设1 bp相当于660Da，计算DNA的终浓度（pmol/ml）。

4、将载体DNA去磷酸化。

5、按下表将适量的DNA转移至无菌的0.5ml离心管：

1 载体DNA 已进行去磷酸化

2 外源目的DNA 可以连接接头。

3 连接反应中，质粒载体和插入的DNA 片段摩尔比一般为1：1。DNA 的总浓度应约为10ng/μl。

（1）A、B和C管中加入：

10×连接缓冲液 1.0μl

T4噬菌体连接酶 0.5 Weiss单位

5 mmol/L ATP 1.0μl

H2O 补至8.5μl

30%PEG 8000 1~1.5μl