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葡萄球菌蛋白A

2024-09-26 DNA 加入收藏

第二节　葡萄球菌蛋白A（SPA）葡萄球菌蛋白A（Staphylococal Protein A, SPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。早在1940

第二节　葡萄球菌蛋白A（SPA）

葡萄球菌蛋白A（Staphylococal Protein A, SPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。早在1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀。Jensen（1959）也发现类似现象，并将其命名为A抗原。直到1963年Lofkvist等分离了该抗原，并证明它是一种蛋白质。为与A与糖相区别，Grov（1960）将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称SPA或蛋白A（Protein A）。由于SPA的一些免疫特性，它已引起广大免疫学者的兴趣，并发展成为免疫学上一种极为有用的工具。

一、SPA的性质

（1）SPA存在于大多数（90%）金黄色葡萄球菌中，而不存在于表皮葡萄球菌中。并且主要存在于血浆凝固酶阳性菌株，而不存在于阴性菌株中。前者是致病的，后者是非致病的，但在体内研究中尚未发现SPA和菌株致病性之间有任何肯定的关系。不同菌株间的SPA含量有明显差异，以I株金黄色葡萄球菌含SPA量最高，SPA和细胞壁的肽聚糖呈共价结合。抗二甲氧基苯青霉素突变株（Methicillin―resistant strain）能产生分泌性SPA，它较之细胞壁所含的SPA在免疫学性质上相似，但易分离，损失少。

（2）SPA为蛋白质成分，仅含少量或不含碳水化合物，其分子量因提取方法不同而异，用脱氧核糖核酸酶消化细胞壁后超速离心或用加热油提法，所测分子量为12000～15000。用沉淀平衡分析和在6mol/L鸟嘌呤盐酸盐中凝胶过滤，测出分子量为42000。SPA为多肽单链，内含3个高度相似的Fc段结合区，每区由50个以上的氨基酸组成，不含色氨酸和半胱氨酸。其羧基末端是赖氨酸，氨基末端结构尚未肯定。SPA粘度高于球蛋白，等电点为pH5.1，其天然结构十分稳定，在应用6mol/L鸟嘌呤盐酸盐变性剂的条件下，尚能保存某些三级结构，如将此变性剂除去，则能自然矫正而恢复原有结构。

（3）SPA之所以引起免疫学家的重视，是因为它具有的免疫学特性。SPA具有和人与许多动物如豚鼠、猪、小鼠、猴等IgG结合的能力。SPA结合部位是Fc段而不是Fab段，这种结合不会影响抗体的活性。SPA具有的结合力是双价的，每个SPA分子可以同时结合两个IgG分子，也可一方面同IgG相结合，一方面与标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等相结合。还有一个饶有兴趣的事实是，和SPA结合后的IgG可用4mol/L鸟嘌呤盐酸盐等使之解离。SPA对IgG免疫球蛋白亚型的结合有选择性，如SPA与人IgG亚型：IgG1、IgG2、和IgG4有结合力，唯独不结合IgG3。只结合IgA2，而不结合IgA1。SPA和禽类血清IgG不结合。

（4）SPA具有多种生物学作用，如引起豚鼠解离体回肠和收缩，在吞噬反应中抑制IgG调理素吞噬和杀菌作用，SPA―Igg 复合物能固定人的补体和人、狗、猪的新鲜补体，对人类B细胞具有促有丝分裂因子的作用等。

二、SPA的应用

　　自70年代开始，国外应用SPA建立了许多敏感、特异性强、快速和简易的实验方法，并在许多方面的应用中积累了实际应用的材料，现已广泛应用到免疫学及其相关科学如细胞学、细菌学和病毒学等。其可能应用的范围可归纳为以下四个方面：

　　1．应用于免疫球蛋白的制备和分析　SPA是一种比较理想的提纯和分析免疫球蛋白的试剂。由于SPA与IgG及其某些亚型的Fc段有较强的结合力，可利用来提纯、分析免疫球蛋白制剂，结合后的PSA―IgG可再用解离剂如4mol/L尿素、4mol/L，硫氰酸盐或6mol/L的鸟嘌呤盐酸盐使之解离，多用SPA―Sepharose 层析柱分离IgG或其亚型及断片如Fc、Fab等。

2．应用于免疫细胞化学　由于SPA具有双价结合力，在免疫细胞化学技术中可作为桥抗体或标记抗体。由于SPA能与多种动物的IgG的Fc段结合，因此，作为第二抗体或标记抗体，SPA的最大优点是不受种属特异性的限制，故在目前各种免疫细胞化学技术中已得到广泛的应用。除不受种属限制这一特点外，SPA法还具有染色时间短、灵敏性高和背景染色淡等优点。据报告用国产酶联SPA代替酶标记抗体，应用间接染色，时间较PAP法省时一半。SPA分子量小（13000～42000），易于穿透组织，而免疫球蛋白酶标记抗体为200000，PAP复合物为430000，均较SPA分子量大。

　　3．应用于多种细菌、支原体和病毒等病原体的简易快速诊断可应用SPA菌体作为载体，结合特异性抗体成为一种吸附原，作协同凝集剂，用于某些细菌和病毒的定群和分型（详见第二章　第三节　）。

　　4．可作为一种研究免疫复合物、膜抗原、膜受体和膜Ig的固相吸附剂　Hallgsen用同位素标记SPA测定血IgG的凝集物，发现85%全身性红斑狼疮和42%类风湿病人血清中凝集物增高。SPA用于细胞膜抗原、表面IgG和Fc受体的研究最大特点是能研究活细菌。Ghetie（1976）用SPA致敏绵羊红血球，与经IgG处理的细胞形成玫瑰花环，来鉴定带Fc受体的细胞，反之，如用SPA抑制玫瑰花环形成，则可定量测定细胞表面的IgG。应用SPA与胶体金或铁蛋白相结合，可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位。特别是蛋白A―胶体金技术（Protein A―Gold technique, PGA技术）自Pomano和Romano（1977）首次报告用于标记细胞表面抗原、包括淋巴细胞、血小板、大鼠肾脏细胞及感染的病毒细胞获得成功以后，已得到愈来愈广泛的应用（详见第七章　），是一种较为理想的免疫电镜技术。

三、SPA在免疫细胞化学染色中的应用

SPA可为多种示踪物如荧光素、酶、胶体金、铁蛋白等所标记，应用较广的为酶标记SPA和金标记SPA技术，后者将在第七章　中叙述。标记SPA常用的酶为HRP。可应用于间接法。SPA在PAP法中可代替桥抗体。

1．SPA―HRP用于间接法的操作步骤

（1）切片经脱蜡后用0.5%H2O2―纯甲醇液处理5min以抑制内源性过氧化物酶活性。

（2）用Tris盐酸缓冲液（0.05mol/l pH7.6）洗2次，每次3min。

（3）以第一抗体血清覆盖处理切片，37℃，孵育30min，或4℃24～48h。

（4）用Tris-HCl缓冲液洗3次，每次5min。

（5）加SPA―HRP（1：100～1：400）处理30min。

（6）Tris-HCl缓冲液洗3次，每次5min。

（7）DAB―H2O2显色。

（8）复染、脱水、透明、封固。反应物为棕色。

2．SPA用于PAP法的操作步骤