淋巴细胞增殖功能的测定

　(一)　原理 　　T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA),抗CD２、抗CD３ McAb作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖；而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体(SAC)、脂多糖(LPS，对小鼠有作用)则刺激B细胞发生增殖；美洲商陆(PWM)、肿瘤刺激剂PMA对T、B细胞的增殖均有刺激作用。最近发现,integrin家族中VLA组中某些受体与相应配体结合后也能活化T细胞。目前临床上最常选用 PHA刺激 PBMC, 根据形态学或氚标记胸腺嘧啶核苷(３H-TdR)掺入率测定T细胞的增殖水平。 　　(二)　操作步骤 　　　　　　无菌从肝素抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC) 　　　　　　洗涤后用10％FCS RPMI1640调整细胞数为1～2×10６／ml 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　加入96孔培养板中，1～2×10５细胞／100μl／孔，每组设3孔。 　　　　　　加入最适剂量PHA，100μl／孔，同时设不加PHA阴性对照。如观察细 　　　　　　胞因子(如IL-2)或其它刺激物(PMA)对增殖功能的调节作用，则根据 　　　　　　加入因子的浓度而确定加入量，一般每孔最终体积为200μl 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　37℃、5％ CO２孵育，66h 　　　　　　　　每孔加入0.5～1μci　３H-TdR(50μl) 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　继续培养6～12h 　　　　　　　　　用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集仪收集样品 　　　　　　　　　于"9999"型玻璃纤维滤纸上 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　　　　烤干后β液闪仪计数 　　计算 　　1.　增殖水平直接用CPM值表示。 　　2.　也可用刺激指数(SI)表示: 　　　　　　　　　　　　PHA(或实验组)cpm-机器本底 　　　　　　　　　SI＝─────────────── 　　　　　　　　　　　　　阴性对照组cpm-机器本底 　　(三)　 试剂 和器材 　　1.　PBMC或其它含淋巴细胞的悬液。 　　2.　PHA或其它有丝分裂原、刺激物 　　3.　闪烁液　PPO(2，5-二苯茎恶唑)3～5g 　　　　　　　　POPOP[1，4双(5苯基恶唑)苯] 0.3～0.5g溶于1000ml二甲苯中。也可将POPOP加入少量二甲苯在37℃ 水浴 上溶解后，再加PPO，然后补足二甲苯。 　　4.　３H-TdR，一般临用时稀释 　　5.　10％FCS RPMI1640, CO２孵箱 　　6. 细胞收集仪，β 液闪仪 　　(四)　注意事项 　　1.　注意无菌操作。 　　2.　PHA、ConA、PWM、LPS等在正式实验前均需摸索最适剂量或亚适剂量。犛I于厂家和批号不同丝裂原作用常有很大差别，如Wellcome公司PHA终浓度最适剂量为1～3μg／ml，而广州医工所PHA约为20～100μg／ml。 　　3.　根据实验需要,对不同种(人、小鼠、大鼠、兔、狗等)不同来源淋巴细胞(胸腺、脾脏、淋巴结、扁桃腺、外周血等)均应进行最适细胞浓度、犈`养时间和刺激物浓度的摸索。