免疫球蛋白提取技术(Immunoglobulin isolation technique)

免疫球蛋白（Immunoglobulin Ig）的含量代表着机体体液免疫的水平，并进一步代表着B细胞的功能，因此测定血清Ig含量可以推知机体的体液免疫功能和诊断某些疾病引起的Ig的过高和过低。 随着免疫学的发展和需要，免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多，有单一法，但大多数采用二步法以上相结合的方法，特别是以硫酸铵提纯为基础，再经过层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。 硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同，利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提，为了获得纯化的免疫球蛋白成分，必须进一步采用层析的方法进行分离。 免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。 一、 IgG的分离与提纯 （一）材料与 试剂 配制 1．动物血清 2．硫酸铵饱和溶液 硫酸铵 800g~850g H 2 O 1 000ml 加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH 4 OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。 注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H 2 S，静置过夜后滤过，加热蒸发H 2 S即可。 3．0.01Mol/L pH7.4PB液 A液：0.10Mol/L NaH 2 PO 4 液 NaH 2 PO 4 ·2H 2 O 15.60g 加H 2 O至 1 000.ml B液：0.10Mol/L Na 2 HPO 4 液 Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 35.80g 加H 2 O至 1 000ml 取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。 4．1％BaCl 2 溶液 5．纳氏液 HgI 115.00g KI 80.00g 加H2O至 500.00ml 溶化后过滤，然后再加20％NaOH500.00ml，混合即可。 6．0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。 7．洗脱液：0.03Mol/L的NaCl液。 8．透析袋（或玻璃纸）。 （二）操作方法 1．取20ml血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入(NH 4 ) 2 SO 4 饱和溶液10ml，使成20％(NH 4 ) 2 SO 4 溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。 2．3 000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。 3．在上清液中再加(NH 4 ) 2 SO 4 饱和溶液30ml，使成50％(NH 4 ) 2 SO 4 溶液，充分混合，静置30min。 4．3 000r/min离心20min，弃上清。 5．于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml，使成33％(NH 4 ) 2 SO 4 溶液，充分混合后，静置30min。 6． 3 000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2~3次。 7． 用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。 8． 透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次。 以1％BaCl 2 检查透析液中的SO 4 2- 或以纳氏 试剂 检查NH 4 + （取3~4ml透析液，加试剂1~2滴，出现砖红色即认为有NH 4 + 存在），直至无SO 4 2- 或NH 4 + 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。 9． 离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提IgG （即γ球蛋白，如以36％的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白)。 10．过DEAE－纤维素层析柱。（装柱过程见层析技术）。以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaCl）洗脱，收集洗脱液。 也可采用SephadexG150或G200柱。 11．蛋白质及其定量鉴定（见本章第八节）。 12．IgG的纯度鉴定 可采用下列方法之一鉴定。 ⑴ 区带电泳：玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后，只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度(NH 4 ) 2 SO 4 盐析样品进行电泳，以资比较。 ⑵ 琼脂双相双扩散鉴定：预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散，如IgG提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。 ⑶ 免疫电泳鉴定：（操作见第三章免疫电泳部分）。孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗IgG血清，琼脂扩散24h，观察结果。如果提取的IgG纯的话，则只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。 ⑷ 圆盘电泳鉴定：用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的IgG则只有一条区带。 13．IgG的浓缩与保存 ⑴ IgG的浓缩：参看本章第九节。 ⑵ IgG的保存：一般浓缩至1％以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加0.01％硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。