RNA的斑点杂交--样本RNA点膜

一、试剂与仪器

1. 20×SSC（标准柠檬酸盐缓冲液）（pH 7.0）

NaCl 175.3g

柠檬酸钠 88.2g

加H2 O至 1000ml

用10N NaOH or 10N HCl调pH至7.0，高压灭菌。

2. 37%甲醛

3. 甲酰胺

4. 2×Denhardt液

5. 硝酸纤维素膜

6. 多孔过滤加样器和真空泵

7. 恒温水浴摇床

8. 加样器和吸头等

二、操作步骤

1. 样本RNA变性：

20 μl RNA溶液（2μgRNA）

4 μl 20×SSC

14 μl 37%甲醛

40 μl 100%甲酰胺

将上述溶液均匀，置60℃温育30 min，冰浴冷却样品，使样本RNA变性。在上述RNA液体中每100 ul液中加210 ul 20×SSC（共310 ul），作为点样溶液，点样时每孔加150 ul。

2. 纤维素膜处理：硝酸纤维素膜（0.45 um）水中浸泡5 min，再用20×SSC室温浸泡1h。

3. 滤器的处理及点样：用0.1 M NaOH浸泡（洗）多孔过滤加样器，再用灭菌水彻底冲洗。将纤维素膜压在多孔加样器的上层板的上面，再压在下层板上，赶去气泡，然后两部分夹紧，点样前，先用20×SSC（200 μl）洗一遍每个孔，真空抽吸干净后，再分别点样。

如有未点样孔须用150 ul 的20×SSC封住其孔，然后用真空泵抽吸干净，再用20×SSC清洗一次，待流体滤过纤维膜后，继续抽吸5 min 以干燥滤膜。

4. 取出膜，80℃烤2~3 h，膜保存于-20℃。