鼠脑RNA提取、RT－PCR及GST融合蛋白纯化

鼠脑RNA提取、RT－PCR及GST融合蛋白纯化

一．鼠脑RNA提取 （1）RNA提取常用3种方法：A.异硫氰酸胍、氯化铯密度梯度分离植物RNA B.SDS－酚－氯仿法 C.硫氰酸胍－酚－氯仿法在制备用于反转录PCR的RNA时最实用

（2）总RNA的提取方法是基于RNA与其他胞内大分子在溶解性和沉降性上的差异得以实现的，提取基本步骤： 1.破碎细胞 2.RNase失活 3.RNA去蛋白 4.RNA与其他大分子的物理分离：酚、离子变性剂和胍盐组合抽提(酚、氯仿抽提步骤，将RNA从DNA中分离出来，在操作过程中的酸性条件下，DNA溶解性降低，大部分留在有机相，RNA则进入水相) 5.将RNA抽提到水相后，用盐将之在乙醇或异戊醇中沉淀下来。

（3）RNA极易降解，要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性RNA酶对RNA的降解。 1．外源RNase污染可通过预先采取措施避免。 ①实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶污染，用0.1%DEPC的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，小指管、PCR管和其他用品。浸泡12h后，121℃高压灭菌30min（2次），70℃—80℃烘干。 ②取鼠脑的剪刀、研钵、镊子等干热灭菌：160℃，2小时。 2．内源RNase在一些组织中，如胰腺中相当丰富，内源RNase活性可通过使用足量的胍盐、酚、SDS或其他的强变性剂得以大大降低。 3．如果发生了不可解释的降解，就应该考虑加入RNase抑制剂。

（4）TaKaRa RNA提取试剂盒提取RNA（稍做改动） Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol适用于从多种组织和细胞中快速分离总RNA。 1．用液氮速冻，将组织磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，把粉末转移到eppendorf 管中，每50—100mg组织加1.0ml的 Trizol。（匀浆的样品可在-60—-70℃保存至少一个月） 2． 匀浆后的样品15—30℃温育5分钟（使核蛋白复合体彻底解离），加入200µ l氯仿，用手剧烈振荡混匀15秒，冰浴2—3分钟。 3． 用台式离心机，不超过11400转/分，2—8℃离心15分钟。混合物分3层：下层红色酚氯仿相，中间层和上层无色水相。RNA在水相中，水相体积约为Trizol体积的60％，即0.6ml。 4． 将水相小心转移到RNase-free 1.5ml离心管里，加入0.5ml的异丙醇(沉淀RNA)，-20℃静置20分钟。（不要吸取任何中间层物质，否则会出现Genomic DNA污染。） 5． 用台式离心机，不超过11400转/分，2—8℃离心10分钟。此时在管底和管壁可见沉淀的RNA，为凝胶状小球。 6． 小心移去上清液，防止沉淀丢失。 7． 用75%酒精洗涤1次，至少1ml，涡旋振荡混匀，不超过8900转/分，2—8℃离心5分钟。 8． 尽可能彻底地吸走上清，防止丢失RNA沉淀。 9． 空气干燥或真空干燥5-10分钟（不可真空离心干燥）。 10．50μl DEPC-H2O溶解。用枪吹打几次使RNA溶解，存于-20℃。

二．RT－PCR （1）逆转录(20μl)，依次加入： 1．MgCl2（25mM） 4μl 2．无Rnase H2O 1.5μl 3．10×RNA PCR buffer 2μl 4．40单位/μl胎盘抑制剂 0.5μl 5．dNTP 混合液(各10mM) 2μl 6．特异性引物（终浓度2pM） 4μl 7．样品RNA 5μl 8．AMV反转录酶 1μl 温育在42℃反应60min 反应管99℃加热5min，使反转录酶失活和RNA-cDNA杂合物变性。

（2）PCR(50μl体系)：（逆转录20μl体系每管分装2管10μl＋以下40μl组成50μl PCR体系) 1．无Rnase水 23.5μl 2．10×RNA PCR buffer 4μl 3．MgCl2（25mM） 3μl 4．上游引物（终浓度0.8pM） 4μl 5．下游引物 4μl 6．TaKaRa Taq 1.5μl 94℃ 预变性3 min 40个循环 94℃30s 两个温度50℃/55℃30s 72℃45s

72℃10min 取扩增样20μl，用1.2%琼脂糖凝胶电泳来分析扩增结果。不用甲醛变性胶，普通琼脂糖凝胶即可。

用特异性5’和3’引物PCR失败，改用oligodT代替特异性3’引物后得到的片断小于目的片断，分析认为是RNA二级结构严重，尝试65℃保温消除二级结构的方法进行RT-PCR，即将特异性引物和总RNA混合后先65℃保温10分钟，再加入dNTP等其他成分，结果表明该法可行。

三．GST融合蛋白纯化 （1）GST亲和纯化 1．介质保存：20％乙醇 2．所需试剂： ①10×PBS（1L）： pH7.4 (4℃) 150mM NaCl（87.75g），16mMNa2HPO4(57.3g)，4mM NaH2PO4(6.24g) ②10×洗脱前buffer（100ml）： pH8.0 (25℃) 50mM Tris（6.1g），100mM NaCl(5.8g) ③洗脱buffer即凝血酶酶切buffer(500ml)： pH10.0 (25℃)加入谷胱甘肽后pH变为8.0 50mM Tris（3.035g），100mM NaCl(2.925g) 洗脱前加1M CaCl2至终浓度2.5mM，加还原型谷胱甘肽（干粉）至终浓度20mM 也有文献使用谷胱甘肽终浓度为10mM，未对比过。 8ml介质结合的融合蛋白一般用30ml洗脱buffer（加75μl CaCl2和0.12g还原型谷胱甘肽） ④3M NaCl

3．纯化步骤及注意事项： ①PBS平衡柱子：至少5个柱体积 ②上样：经对比发现，上样流速需极慢才能结合，一般上样过夜（纯化原理是谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白对谷胱甘肽的亲和力） ③PBS洗杂蛋白：洗到紫外监测基线平，至少1小时，时间充分的话最好用较慢流速洗2到3小时，这样洗脱下来的目的蛋白中杂蛋白较少。 ④洗脱前buffer换体系：至少2个柱体积，8ml介质一般用20ml ⑤洗脱buffer洗脱蛋白：洗脱速度很快，一般第2、3管浓度最大，注意收峰 ⑥3M NaCl再生柱子：一般会洗出一个小盐峰，再生时间不可过长，否则对柱子有伤害，5个柱体积即可

（2）凝血酶酶切融合蛋白（以NGB为例） 先后使用过sigma和鼎国的凝血酶，sigma的酶效率更高。 鼎国凝血酶买来为干粉，3000U每管，溶于1ml凝血酶酶切buffer（补1M CaCl2至终浓度2.5mM），分装至每管10μl共100管，30U/管。 合并GST柱下来的目的蛋白，紫外分光光度计OD595测蛋白浓度。用鼎国凝血酶摸酶浓度：每35mg蛋白用凝血酶50μl，酶切约20小时。 对比25℃水浴酶切和摇床中酶切，定时取样检测酶切结果，发现摇床中酶切更快（可能是摇动过程中酶与蛋白能充分结合），但摇床中酶切产生的沉淀也更多。 四．我负责配制的几种试剂 （1）蛋白marker： 鼎国marker：直接分装，5μl/管 华美marker：每瓶干粉加300μl水和100μl 4×loading buffer，充分溶解混匀后分装于40管500μl小指管，10μl/管，沸水中煮3－5分钟。（小指管一定要盖严，否则煮时进水） （2）IPTG：（500mM）分子量238.31 在超净台中操作， 一般一次配5g，将干粉溶于42ml milliQ水，经一次性滤器滤过后， 分装至灭菌小指管中。（IPTG一定要充分溶解） （3）氨苄：（50mg/ml） 在超净台中操作， 一般一次配5g，将干粉溶于100ml milliQ水，经一次性滤器滤过后， 分装至灭菌小指管中。