Northern blot protocol

1.Total RNA isolation： 测定OD 260 ，OD 280 及两者比值，换算出RNA的浓度。并电泳鉴定。 2.Gel： 以80ml的1.5％甲醛琼脂糖凝胶为例： agrose：1.2g dd H 2 O：57.6ml 10×RNB*(RNA buffer)：8ml（RNB具体配方见后，用*表示，下同） 甲醛溶液：14.4ml 3. Electrophoresis： （1）加样：（以取20μg RNA为例）在0.5ml管中加20 μg RNA＋2－4倍RNA体积的SB溶液* ，votex，65℃热变性10min，立即上冰5min，微离心一下，加相应的10×loading buffer（大连宝 生物 公司taq酶系列会提供），混匀，准备上样。 （2）预电泳：在正式上样电泳前，在胶点样孔中各加一点10×loading buffer（加的孔数要超过正式电泳所用的点样孔）先看点样孔漏不漏，预电泳15－20min。此工作可在RNA变性时进行。这一方面可判断胶漏不漏，另一方面可使胶活化。 （3）正式电泳：将（1）步的混匀样全部加入点样孔，50V电泳4－5小时（电泳时间长短还要依你胶的大小而定，一般要使loading buffer跑到四分之三左右。 电泳最好在4℃冰箱里进行，并且要有循环器在电泳缓冲液两边进行交换，以防两端缓冲液PH相差过大。电泳缓冲液用1×RNB。 4.转膜： （1）在转移槽内放好玻璃板，铺好滤纸桥，紧贴玻板。 （2）倒入转移液（20×SSC*），浸透滤纸桥，驱除气泡，同时按胶大小剪好合适的膜（膜为Amersham公司的Hybond－N＋膜）和两张同样大小的滤纸。 （3）将胶从加样孔先接触滤桥面，自一端将胶滑放至滤纸桥上，注意不留气泡。 （4）将膜放在胶上，小心慢速，自一端起紧贴胶面，检查及排除气泡，用一干净玻棒轻缓的在膜上滚几下以排除气泡。 （5）用保鲜膜在四周封边，在尼龙膜上放上两张滤纸片，再堆上5－8cm吸水纸堆，压上重物，10－24hr。 （6）转膜完毕，移去吸水纸，将膜取出，紫外交联（245nm1.5J/cm2照射膜1min45s）并标好膜的正面及加样顺序，将膜在6×SSC或2×SSC溶液中浸泡一下，纯水冲洗一下。 （7）用亚甲基蓝溶液浸泡摇晃染色3－5min，纯水摇床脱色，可见RNA电泳条带，标好28S，18S。 5.探针的标记：（下列物质除α- 32 P dATP购自Amersham公司，其余来自于Promega公司的labeling kit） （1） 取25－40ng的模板DNA（假设以1μL为例）于0.5ml管中，加11μL dd H 2 O,100℃变性5－10min，立即上冰5min。 （2） 在冰上依次在管中加入： BSA: 1μL dNTP(-dATP):1μL labeling 5×buffer: 5μL klenow酶：1μL（5U/μL） α- 32 P dATP(最后加) 5μL （合计：25μL体系） 振荡后放入铅盒，37℃ 1hr，加200μL dd H 2 O终止反应。可4℃短暂保存。 6.探针的纯化（sephades G－50柱层析法）： （1）1ml注射器底部用无菌玻璃棉填塞，加剪盖的0.5ml管放入体积较大的 离心管 中，注射器中装填用ＳＴＥ平衡的sephades G－50凝胶。 （2）层析柱室温离心，1000g×2min，再重复步骤（1）（2），使注射器装满sephades G－50凝胶。 （3）将标记好的探针滴加在层析柱上，离心，1000g×4min，收集0.5ml管中液体，即为纯化好的标记cDNA探针。