关于RNA制备的技术解答

1、RNase 是RNA制备的杀手 RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。   2、塑料制品、玻璃和金属物品的处理 (a)塑料制品：尽可能使用无菌，一次性塑料制品。已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理方法如下： (1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。 (2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 (3)在通风柜中室温处理过夜。 (4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。 (5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 (b)玻璃和金属物品 250°C烘烤3小时以上。   3、采用什么方式纯化总RNA？ 答：我们提供多种RNA纯化方式，根据您对RNA纯化技术的熟悉程度，选用不同的纯化手段。从产品使用效果看，基于TriBlue的一步法分离总RNA 试剂 盒（K311,K321系列）无论是新手还熟手都可以得到比较理想的结果。如果您对苯酚过敏，出于对环境的保护，您可以选用整个分离流程都不使用苯酚的 试剂 盒（K361系列）。从产品形式上，我们的总RNA分离分醇沉淀离心式和离心吸附柱方式两种。沉淀方式总的产量比较高，纯化规模机动，但是纯度不及吸附柱方式；吸附柱方式操作比较简单，纯度高，受吸附容量的影响，产量收到影响。   4、什么时候需要分离mRNA? 答：常规RT-PCR鉴定基因表达水平的，一般都可以采用总RNA作为RT-PCR 的模板，但是做cDNA文库，克隆丰度极低的基因，大多数DD-PCR， 削减杂交等需要纯化的mRNA。一般用oligo (dT)-cellulose或在磁珠上偶连oligo (dT)，从组织或总RNA种直接分离mRNA。   5、如何判定分离的总RNA的纯度？ 答：需要从两个方面着手，缺一不可，特别是新手（1）测定OD260/OD280的比值，测定时，RNA需要用10mM Tris-HCl,pH7.5稀释。理想的RNA, OD260/280在1.9-2.1之间。比值如果过低，可能有蛋白质污染，过高RNA可能已发生降解。（2） 琼脂 糖变性电泳观察rRNA的完整性和强度。变性电泳需要采用 MOPS 系统，不可以采用DNA 电泳用的TBE或TAE系统。如果OD260/OD280过低（<1.7），通常可以通过减少组织和细胞的用量来实现。   6、什么时候需要加入RNA-Carrier? 答：样品很少或样品中RNA含量低，制备RNA时需要加入一定的 RNA载体，以提高RNA纯化的得率。常用的载体有PolyAcryl Carrier, Poly A, Poly C和Glycogen。一定浓度范围的 Carrier对一些RNA的下游应用没有影响，如RT-PCR, Northern Blot。     7、如何除去纯化的RNA中微量的基因组DNA? 答：无论用种方式制备的总RNA,要绝对保证不含基因组DNA是不现实的。如果您希望得到DNA free 的RNA样品，需要用RNase free的DNase I处理。   8、纯化的RNA样品如何保存？ 答：如果希望得到最佳的结果，纯化的RNA需要立即用于下游实验。RNA可以保存在-80C冰箱，长期保存可以置于液氮中。如果没有-80冰箱或液氮，RNA也可以保存在异丙醇或乙醇中，-20度保存。   9、组织和细胞样品如何收集，保存？ 答：组织样品收集后，需要立即保存在液氮中，或在样品中加入一定量的保护剂，有一些商业化的产品可以选用。一般实验收集50-100mg组织就足够了。   10、如何估计RNA的产量？ 答：能计算出RNA的产量，通常都是有比较多的起材料，但是很多情况下能够取得材料很少，所制备得到的RNA无法通过分光光度的方法测定含量和浓度。RNA的含量与组织和细胞的类型有比较大的关系, 同时与抽提的方式有关，例如用抽提小鼠组织100mg 肝可以得到500ug总RNA, 100mg肺 得到200ug总RNA, 1百万个细胞Hela细胞可以得到15ug左右的总RNA. mRNA的含量一般占总RNA含量的2-5%。根据这样一些经验值，估算出您可能得到的量。样品如果低于20mg或10000个细胞，在抽提时需要考虑加入合适的RNA沉淀载体。   11、RNA制备过程中那个环节要特别注意？ 答：一般情况下，细胞和组织在RNA抽提液中都可以保存一段时间，因为几乎所有的RNA的抽提裂解液中都含有高浓度的异硫氰酸胍等强变性剂, RNase基本是不起作用的，操作即使是粗放一些，也没有多达关系。但是通常是离心后取上清，这时候RNA已没有保护，操作要特别小心。