RNAi常见问题及问答（FAQs）

有关Stealth™ RNAi的问题 什么是Stealth™ RNAi？ Stealth™ RNAi是RNAi化学的新一代产品。Stealth™ RNAi分子是经过专利化学修饰的、钝末端、双链25聚体（25mer）。这些化学修饰专门用来消除诱导的细胞应激反应。它也使Stealth™ RNAi比标准的siRNA在血清中更稳定，通过确保Stealth™ RNAi双链中只有反义链进入RNAi通路，减少脱靶效应（off-target）的可能性。 如何设计Stealth™ RNAi？ RNAi Designer 免费在线工具是设计有效Stealth™ RNAi的理想工具。RNAi Designer使用独特的、基于公开设计法则的算法（algorithm），复杂的同源消除以及获得的来自invitrogen广泛的成功的RNAi实验室数据。使用RNAi Designer，你可以设计独一无二的Stealth TM RNAi分子，来靶定目的mRNA分子，进行有效的基因阻断。如果你现在已经有一个效果良好的siRNA 序列，把它转变成有效的双链Stealth™ RNAi非常简单，同时你可以获得Stealth™ RNAi所有的优点。 如何知道siRNA或者Stealth™ RNAi不会靶定其它的基因？ RNAi Designer利用严格的设计法则选择Stealth™ RNAi，选择的Stealth™ RNAi对于你所选择的有机体是独一无二的。由于只有反义链能够产生RNAi反应，因而Stealth™ RNAi是消除这些问题的最有效的方法。 我需要多大量Stealth™ RNAi？ Stealth™ RNAi以20 nmole 退火双链提供，提供24孔板大约2000次转染。如果有要求，invitrogen可以提供大规模选择序列的合成。 如何我能够知道使用什么序列？ 你可以使用RNAi Designer在线工具设计Stealth™ RNAi的序列。Invitrogen 客户服务也可以帮助你设计和在目标细胞类型中验证序列。 Stealth™ RNAi有多稳定？我能够在体内研究中使用它吗？ 在血清中Stealth™ RNAi明显的要比siRNA稳定。增加稳定性特别有利于体内研究，在体内RNAi可能暴露到更多的核酸酶中。通过与Introdigm合作，已经证实Stealth™ RNAi体内肿瘤内注射具有活性。 是否BLOCK-iT™ Basic RNAi Control Kit 和 Transfection Optimization Kit中的荧光oligo（fluorescent oligo）修饰作Stealth™ RNAi？ 荧光oligo是修饰的荧光标记的dsRNA。RNA上的这种修饰促使它以一种清晰和稳定的方式定位到细胞核，使得它成为转染的一种出色的对照。相反，简单的荧光素标记的siRNA导致模糊的模式，难以区分荧光oligo是进入细胞或者是仅仅黏附到细胞的外面。 我是否可以使用BLOCK-iT™荧光oligo优化质粒转染？ 已经显示BLOCK-iT™荧光oligo的转染与Stealth™ RNAi和siRNA的转染相关，但是DNA和BLOCK-iT™荧光oligo的相关性还没有进行检验。 一般RNAi问题： RNA干扰（RNAi）是如何被发现的？ 1990年，Jorgenson 和 Mol在研究一种模式植物系统的工作中，第一次发现RNA干扰现象存在的迹象。存在天然色素基因附加拷贝的矮牵牛花（Petunias）似乎以某种方式同时阻断了天然和插入色素基因的表达，被称之为协同抑制。几年后，研究烟草的另外一个小组发现，病毒能够启动特异基因的抑制。Andrew Z. Fire 和 Craig C. Mello在实验室中发现注射dsRNA到线虫（C. elegans），导致与导入dsRNA同源的那些特异基因表达的沉默，而后，在1998年nature上发表的文章中创造了术语RNAi 。 RNAi 天然生物学功能是什么？ 几乎所有的植物和动物细胞都具有利用siRNA的内部机制，使用siRNA抑制特殊基因的表达。RNAi进化的机制，似乎是为了保护基因组免于内源转位因子和病毒感染的损害。RNAi可能在细胞中有正常的功能性作用，在生长和发育期间抑制一些基因的表达。 RNAi优于用来进行组断基因表达的其它方法的优点是什么？ 基因敲除和转基因动物是功能缺失表型研究的主要方法。然而，获得这些动物是一个漫长而且费用昂贵的过程，同时很多基因的缺失会导致胚胎致死表型，使得基因敲除变得不再可能。 灭活蛋白功能的方法包括结构域阴性突变构建和分析，和使用抗体和aptamers。但是，这可能需要花费一些时间确定什么构型和结构有功能，而且它们似乎只对某些靶标有作用。 有两种方法被用来调节mRNA的更新，反义mRNA和核酶（ribozyme）。但是这两种方法的应用有很大的限制。 RNAi是快速鉴定基因功能而费用低廉的方法，似乎对于到目前为止检测的大多数基因效果良好。RNAi迅速成为在敲除目的基因表达方面使用更多的方法。RANi对于了解基因功能，信号通路分析，RNAi机制研究和靶标验证非常有用，同时展示了诊断学和治疗学的巨大潜力。 获得短的干扰RNA（siRNA）的方法有哪些？ 获得导入哺乳动物细胞siRNA的3种最常用的方法： · 体外转录和Dicer酶切（dicing） · 合成siRNA · 带有RNAi框的载体 siRNA和diced siRNA（d-siRNA）之间有什么差别？ 二者的分子结构是相同的，dicer将长dsRNA特异的裂解为21-23个核苷酸双链，具有siRNA标志的两个核苷酸的突出。主要的差别是d-siRNA是包含一个来源于一个完整全长的dsRNA靶标的siRNA库，而siRNA通常是指特异针对专门靶定区域的单一序列，通常合成为单一Oligo或者特异几种Oligos混合物。 如何测量RNAi的效果？ 检测基因特异阻断的最常用的方法是进行western blot分析，比较导入siRNA前后蛋白表达水平的变化。在一些情况下可能使用检测报告子基因的报告子系统例如β-半乳糖苷酶。也可以应用实时PCR（例如通过使用LUX™引物）或者其它类型基于细胞的分析检测细胞中转录本的水平。