利用单分子分析 “看到” RNAi

在RNAi过程中，siRNA会识别mRNA上的靶点区域，并引导AGO等多种蛋白在该区域组成一个沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），在该区域的特殊位点将mRNA切开，造成mRNA降解，但这个靶点识别、切割及释放的具体过程及分子机制并不清晰。

7月2日发布的Molecular Cell中，来自东京大学和第三军医大学的研究者利用单分子成像分析技术，成功地解析了RISC的工作过程。

本项研究中，研究者首先构建了不同荧光标记的mRNA和siRNA，且它们所携带的荧光标记能够产生荧光能量共振转移，借助特殊的单分子成像分析技术检测不同时间段线虫细胞中荧光信号强度，研究者即可判断出RISC具体状态。

实验结果表明，在RNAi最初的识别阶段，RISC主要依靠siRNA 5’ seed region来识别mRNA靶点区域，5’ seed region突变会大大提高RISC靶点识别时间，而3’ supplementary region则主要负责阻止RISC进入剪切状态，可能与避免siRNA产生脱靶效应有关。

在RISC结合到mRNA靶点区域后，则有可能基于siRNA 5’ seed region和3’ supplementary region内序列GC含量差别产生两种剪切释放形式：若5’ seed region中GC含量相对较高，RISC会将mRNA剪切位点至3’端片段释放。

保留mRNA与siRNA的3’端supplementary region的配对状态，若3’ supplementary region中GC含量相对较高，RISC则会将mRNA剪切位点至5’端片段释放，保留mRNA与siRNA的5’端seed region的配对状态。

单分子分析判断RISC剪切形式

本项研究利用单分子成像分析技术，对RNAi整个过程的分子机制模型进行了完善，利用此技术，研究者已经可以实时地“看到”RNAi靶点识别、剪切、释放整个过程，并对siRNA中不同区域突变与GC含量对RISC剪切模式的影响进行了深度探索，为后续RNAi技术的完善提供了更多新的理论与实验结果，具有重要研究意义。

名词解释：荧光能量共振转移

荧光能量共振转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。

当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。

相关文献：Yao C, Sasaki H M, Ueda T, et al. Single-Molecule Analysis of the Target Cleavage Reaction by the Drosophila RNAi Enzyme Complex[J]. Molecular Cell, 2015, 59(1): 125-132.