质粒载体中平末端片段的克隆

1．分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化1~10μg质粒DNA和外源DNA片段，使它们能产生平末端。2．苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源DNA片段。3．分别用TE（pH 8.0）重新溶解纯化出的两种DNA沉淀，使终浓度为100 ng/ml。 假设1 bp相当于660 Da，计算DNA的终浓度（pmol/ml）。4．将载体DNA去磷酸化。5．按下表将适量的DNA转移至无菌的0.5 ml离心管：   管号DNAA和E载体1 [60fmol (~100ng)]B外源插入片段2[60fmol (~10ng)]C和F载体1（60fmol）和外源插入片段3（60fmol）D线状载体（5’-磷酸化）（60fmol）G环状载体[60fmol (~10ng)]1 载体DNA已进行去磷酸化2 外源目的DNA可以连接接头。3 连接反应中，质粒载体和插入的DNA片段摩尔比一般为1：1。DNA的总浓度应约为10ng/μl。 a.       A、B和C管中加入：   10×连接缓冲液      1.0μl   T4噬菌体连接酶      0.5 Weiss单位   5 mmol/L ATP        1.0μl   H2O                  补至8.5μl   30%PEG 8000          1~1.5μlb.      D、E和F管中加入：   10×连接缓冲液      1.0μl   5 mmol/L ATP         1.0μl   H2O                  补至8.5μl   30%PEG 8000          1~1.5μl   不加DNA酶 6．连接反应体系置于16℃水浴温育过夜或20℃水浴温育4 h。7．用每份稀释的连接产物转化感受态大肠杆菌。转化时，应包括用标准方法制备的已知量的超螺旋质粒DNA作为对照，以检查转化效率。管号DNA连接酶（有/无）预期转化克隆数A载体1+~03B插入片段+0C载体1和插入片段+比F管高5倍D载体1-~0E载体2-比D管高50倍F载体和插入片段-比D管高50倍G环状质粒-2×1051 去磷酸化2 未去磷酸化3 如果出现来自去磷酸化的载体DNA自身连接产物的转化子，是由于用碱性磷酸酶处理时未能除尽5’端的磷酸基。