荧光标记mRNA差异显示技术

mRNA差异显示技术（differential display，DD）是用于研究基因的差异表达的新方法。该技术自1992年被首次报道后，即以其不可替代的优势被广泛应用于生物医学领域。在应用过程中不断得到改进，并产生了诸多衍生技术如RPA（RNA finger printing by arbitrarily primed PCR）、GDD（genomic DD）等。本文简要介绍在本试验室荧光标记差异显示技术（fluorescent DD，FDD）的应用及体会。

1.材料与方法

1.1 标本

人单核细胞系U937，细胞密度2×108/L，分对照组（N）、处理Ⅰ组（T1）、处理Ⅱ组（T 2），N用1640培养基及10%胎牛血清培养，T1用IFN-γ104U/L LPS 1μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0μg/L分别刺激7h.

1.2 主要试剂与仪器

TRIzol试剂（GIBCO BRL）、Fluoro DD试剂盒（Genomyx）、Supersript Ⅱ逆转录酶（GIBCO BRL）、Ampli Taq DNA聚合酶（GIBCO BRL）、RNase-free DNaseI（Promega）；Genomyx LR 、 Genomyx SC、DNAThermal Cycler（Perkin Elmer）

1.3 总RNA的制备

按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总 RNA,以 RNase-free DNase I（终浓度80 000 U/L）除去其中污染的 DNA,经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以紫外分光光度计检 测其纯度

1.4 mRNA差异显示

1.4.1 逆转录反应

选择锚定引物[T7（dT12）AP(anchored prime rs，AP)]，序列为5'ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3'，其中 M=A/G/C。N=A /G/C/T],以总RNA为模板进行逆转录反应，每管反应体系如下：总RNA l.0μg，AP 4 pmol ，70℃ 5 min，加入50 mmol/L Tris-HCl（pH8.3），75 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，10mmol /L DTT，25μmol/L，dNTPmix（1∶1∶1∶1），SuperScriptⅡ 60 Units，总反应体系20 μl ，42℃ 5 min，50℃ 50 min，70℃ 15 min。

1.4.2 荧光标记差异显示PCR

选取与逆转录引物序列相同的带荧光物 质标记的锚定引物[TMR-T7(dT12)AP]，随机引物（5'ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3'），以逆转录产物为模板，进行PCR反应。反应体系包括：20 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），50 mmol/L KCl,3.75 mmol/L MgCl2，逆转录产物3.0 μl，50 μ mol/L dNTP mi x（1∶1∶1），0.35 μmol/L 5'-随机引物，0.35 μmol/L 3-锚定引物，Ampli Taq 0.5 U nits，总反应体系10 μl。反应步骤如下：95℃ 2 min；94℃ 15 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，4个循环； 94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，个循环；72℃延伸7 min。

1.4.3 分离差异显示片段

配制5.6%变性聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.2 5 mm，大小61×33 cm。将PCR产物加4.0μl上样缓冲液，95℃变性后上样。3000V、100W 、55℃电泳4.5 h。干胶后置于Genomyx SC扫描，用系统所带的AcquireSC program软件分 析处理扫描结果。

1.4.4 回收差异条带

用AcquireSC软件将差异条带定位，用一次性手术刀片切割下所需条带，置于30μl去离子水中，37℃水浴30-60 min，备用。

1.4.5 差异条带的再扩增

以经上述处理的回收条带为模板，T7启动子22-mer（5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3’）、反M13（-48）24-mer（5'AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3'）为引物，进行再扩增反应：模板2.0μl，20 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2,20 μmol/L dNTP mix（1∶1∶1∶1），0.2 μmol/L T7、0 .2 μmol/L M13-r、AmpliTaq 1.0 U nits，总反应体系20 μl.反应条件同差异显示PCR。