PCR-SSP分析实验原理和步骤

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PCR 序列特异性引物（sequence specific primer,SSP）分析法

PCR 序列特异性引物（sequence specific primer,SSP）分析法是使用能够特异识别特定等位基因的引物通过PCR 扩增检测序列多态性的方法，也称作等位基因特异性引物PCR 法。本实验是应用PCR-SSP 法检测MN 基因型。[实验原理]根据决定某等位基因的碱基性质，设计3′端第一个碱基分别与各等位基因的特异性碱基相匹配的序列特异性引物，在PCR 反应过程中，只有引物3′端第一个碱基与决定特定等位基因的碱基互补时才能实现DNA 片段的完全复制，根据PCR 产物的有无进行等位基因的分型。[实验器材]PCR 扩增仪、电泳仪、电泳槽。[实验试剂]引物1：5′-GCATCAAGTACCACTGGT-3′；引物2：5′-GCATTAAGTACCACTGAG-3′；共通引物：5′-GAGAAGTTGAGAAAGGGGT-3′。模板DNA、Taq 聚合酶、丙烯酰胺、电极缓冲液、上样缓冲液等[实验方法]1.PCR扩增PCR反应体系为20μl（2个体系，分别为引物1和引物2），含模板2μl(约50ng)，引物各1.5μl,dNTP1.6μl(0.4mM)，10×Buffer缓冲液2μl，Taq酶1.0U，加双蒸水至20.0μl；PCR反应条件为94℃4min,94℃1.5min/52℃2.0min/72℃2.0min，30个循环。2.PCR 扩增产物的检测 取PCR 扩增产物2μl，6%聚丙烯酰胺凝胶电泳（T=6%，C=3.3%，凝胶规格为82mm×64mm×0.75mm）。电极缓冲液为1×TBE。将加有1/5 体积上样缓冲液的酶切产物电泳，220 v 电压，电泳2－3h。银染显色[结果判定]根据电泳谱带的有无判定等位基因型别，仅有1 个体系检测到谱带者为相应特异性引物对应型（M 或N），2 个体系均检测到谱带者为MN 型。[实验讨论]1.注意事项 ①如引物结合序列存在碱基变异可能无扩增产物，导致错误判型；②在对照样品分型准确的基础上才能判定结果。2.方法评价 该方法操作简单，引物设计与实验的复性条件要求较高。