快速PCR浅见 --纪念Kary Mullis获得诺奖30周年

对于PCR实验来说，如何在得到理想的扩增产物的前提下尽可能加快反应进度、缩短反应时间是每个PCR实验人员关心的热点。下面我就这一问题谈谈自己的看法，以便抛砖引玉。

PCR实验所耗的时间大体上可分为三个方面：模板制备、PCR加样与上机反应、反应后的电泳检测和拍照。

一．模板制备

对于模板制备阶段，尽量缩短模板提取时间既有利于缩短整个PCR反应时间又可以尽可能的减少模板降解。

对于纯度要求不高的模板来讲，可以尝试煮沸法提取；而对于纯度要求较高的模板来讲，可以购买核酸提取试剂盒来替代繁琐的手工提取法。对于比较容易裂解的细胞和组织的DNA（如血细胞），可以尝试直接拿来（或适当稀释后）作为PCR反应的模板，这样就可以省略模板制备阶段。

二．PCR加样与上机反应

PCR加样中尽可能将能混合的溶液都混匀在一起，分装后再往各反应管中加入其它溶液，这样既可以加快进度又提高了不同反应间的重复性。

在PCR仪中进行的PCR反应所耗时间＝变性、退火和延伸时间＋仪器从一个温度变到另一个温度所用的时间。

变性、退火阶段的时间可以通过多次实验摸索后适当降低，对于扩增一些长度很短的片段，甚至可以将变性和退火的时间减少到5秒以下。

也可以尝试使用两步PCR法（退火和延伸合为一步）来替代传统的三步PCR，来看是否仍能获得比较理想的产物量。延伸阶段的时间主要取决于采用的聚合酶的延伸速率，所以选用具有更高延伸速率的酶可以降低延伸时间。

PCR仪的升降温速率是影响PCR总时间的另一个重要方面，在其它条件不变的情况下，采用具有更快升降温速率的PCR仪可以显著降低PCR反应所需的时间。

三．反应后的电泳检测和拍照

采用优秀的电泳仪器、凝胶程序系统和凝胶分析软件可以得到更好的电泳结果和更美观的电泳图，因此可减少电泳和拍照失败的可能，加快实验进度