微滴式数字PCR 保护海岸生态系统

Corona Del Mar这个典型的南加州海滩上美好的一天：晴朗的天空万里无云，蔚蓝而清澈的海水泛起层层海浪拍打着白色的沙滩。两位老人漫步在沙滩上，小孩子在他们前面嬉戏追逐着海鸥。今天的海水看起来那么清澈，沙滩上也没有竖起鲜红的指示牌或者黄色的隔离带警告人们远离被关闭的海滩。 这样的景象并非总能看到。由此往北行驶一个半小时，在南加州海岸的另一个著名的地点，这个邻近Malibu Pier的区域最近被自然资源保护委员会（Natural Resources Defense Council）挂名为17个国家级“repeat offencer”海滩之一。

该地区获得这个不幸的荣誉都是因为其超过25%的时间都未能达到水质标准（相同的报道将邻近Corona Del Mar的Newport海滩列为全美的“超级明星”海滩，因为这里保持了良好的水质清洁记录）。

在全国范围内，约10%的海滩其水样中的菌落数量超过了环保署（Environmental Protection Agency, EPA ）认定的对游泳者安全的标准。全美每年总计有20,000天要在某一个海滩竖起红色警示牌，警告人们慎入或者完全关闭海滩。 尽管采取了这些预防措施，但据EPA估计每年仍然有大约三百五十万美国人因污染的海水而患病。罕见疾病少有报道，而常见的肇事者是存在于人类下水道中的普通病毒与细菌，正是这些病原微生物污染了海滩。

它们属于肠道病毒、腺病毒和诺罗病毒诺罗病毒，常常导致食物污染或者普通感冒。大多数美国人不会想到，那些由于患病而被迫缩短甚至取消的假期竟然是因为海滩上糟糕的一天。 Corona Del Mar 是南加州最美丽的海滩之一。然而即使是这样纯净的沙滩也会被病原微生物污染，特别是在加州的雨季，突然出现的风暴会将内陆的污物冲洗到海水中。

名称滑稽的小型机构沿海水污染的源头跟海岸附近的地形以及当地人类的活动有很大的关系，包括排污管线的泄漏，管道系统破损，污水处理系统溢流，污水径流以及污染物进入小溪和河流，甚至包括船只。

“在南加州的这些地方所有的地表都经过了铺装建设，”SCCWRP（Southern California Coastal Water Research Project）微生物部门的首席科学家兼主管John Griffith博士说，“一切都按照防洪设计建造，所以下雨的时候，当有径流出现时或者当消防栓破损时，水都能够尽快流向海滩。”Griffith博士所在机构——那里的人们将机构名称的首字母缩写读作一个词“skwerp”——的任务有两个：研究流入海滩的物质的来源并评估其影响；提出减小危害的方法。

这样一来，SCCWRP的职能就是作为一个独立的研究机构向政策制定者和各级政府组织——上至环保署EPA下至地方上的排污区域——提供公正科学的信息并加以诠释。

该机构的位置靠近Orange县的一个废水处理厂，那里有Santa Ana河的一段铺装过的干枯河床，还有未被污染的Corona Del Mar海滩，这意味着该机构的角色是在人造水系统和自然水系统之间协调斡旋。SCCWRP 扮演这个角色的一个主要途径就是作为改进水质监测手段的实验室。“我们致力于确保我们正在使用最先进的技术手段来保护公众的健康，远离病原体主要是人类排泄物的危害，”Griffith博士说，“也就是说我们是将新技术引入海滩水质监控机构的主要渠道。”滞后且不准确的排泄物污染检测手段全美有各种各样的团体监视着大约3,500个不同的海岸监控点。由于环境样本往往成分复杂，要直接检出其中的病原体如病毒并不容易，监测机构通常另辟蹊径去寻找丰度更高的指示生物。对于水中排泄物污染的检测，肠球菌（Enterococcus bacteria）就符合这项要求。

虽然通常情况下肠球菌本身对人类是无害的，但是肠球菌的存在往往预示着排泄物污染且伴随各种病原体。对水样进行检测分析，计数水样培养出的肠球菌菌落数比率是否超过104CFU/100mL，这样的平板培养法长期以来都被作为危险污染检测的快捷手段。

然而，Griffith博士和他在SCCWRP的同事——高级微生物学家Yiping Cao博士，看到了传统的平板细菌培养法在监测海岸水质时的局限。“主要的问题是需要一整天的时间才能得到答案，”Cao博士说，“培养的过程需要耗时24小时，也就是说你要第二天才能知道结果。在这个时间段，公众依然在取用这些水，如果有污染事件，可能已经发生。”除了获取结果方面的延时，Cao博士还指出，尽管作为一种指示生物有其优点，但肠球菌并不是特异性存在于人排泄物中，而这正是公共健康特别需要关注的问题。由于这些局限，Cao博士已经开始研究可用于水质监控的新技术新方法。“我们在寻求更快、更特异的检测人排泄物的新方法，”她说。SCCWRP的高级研究技师Meredith Raith准备采集Santa Ana河的水样。混凝土涵洞保护着Orange县的周围环境免受洪涝影响，但也将污水从内陆直接导入海湾。从环境到试管：A. 将水样注入到真空过滤器；B. 取下滤纸，然后裂解滤得的微生物；C. 提取的遗传物质用于PCR分析。qPCR 登场，但是……水质监测人员相信对遗传标记的分析相比细菌培养法能更好的提供有关污染的信息。作为可选手段，定量PCR (qPCR) 技术有助于解决肠球菌平板培养法的检测速度慢和特异性问题。

使用qPCR 检测能在几个小时内给出定量的结果而无需一整天时间；此外，研究人员已经设计出了qPCR 检测方法用于测定与人相关的拟杆菌（Bacteroidales），该菌可作为提高人类污染检出率的另一种指示生物。环保署最近就批准了一项肠球菌的qPCR检测方案用于娱乐用水的水质监测。尽管Cao博士将qPCR看作是一个进步，但是她发现qPCR的方法仍然显露出了固有的局限。“qPCR有其自身的缺点，”她说，“其中之一就是依赖外部标准品来定量（肠球菌基因组DNA）。

标准品来源不同可导致检测结果的高度变化。”Cao博士和她的同事主导的一项研究发现，在不同来源的标准品之间，这样的差异可导致检测结果间高达半个数量的差别。

特别是当需要考虑全国3,500个监测点的数据，而提供这些数据的各个组织也许并不都使用相同的标准品时，标准品间差异的影响会变得非常重要。这些数据可能会非常难以在全国范围内进行比较，因而也难以决定什么时候关闭某个海滩。抑制作用是qPCR另一个问题。这是因为环境样本非常复杂，不同时间和地点采集的样本中可能含有多种不同成分。“某些成分会干扰PCR扩增过程，造成qPCR假阳性结果，”Cao博士说：“这对于保护公共健康来说是个大问题。人们倾向于过度保护而非保护不足。”水质监控的数字化在寻求建立一种更好的通过分析遗传标志来监测海岸水污染的技术方法的过程中，Cao博士及其同事调研了Bio-Rad的微滴式数字PCR (ddPCR™) 技术。这种PCR方法可将样本微滴化分割，通过对阳性微滴和阴性微滴的统计学分析获得数字化结果。Cao博士一开始就对ddPCR产生了兴趣，因为与qPCR不同的是，ddPCR不依赖标准曲线就可以获得定量结果。“我们想消除外部标准品带来的不确定性，”她说，“数字PCR的绝对定量能力可产生更具重复性的数据。”

微滴式数字PCR可将反应体系分割成约20,000个均匀的微滴，每个微滴都是一个独立的PCR反应单元；PCR反应后微滴经过逐一读取分析，会被判读为阳性或阴性；阳性微滴的比例经软件转换即可获得高精度的模板浓度。因为数字PCR检测反应终点的荧光信号而不是动态的荧光变化，所以可以克服PCR抑制的问题。“抑制问题得到了根本的解决，”Griffith博士说，“由于扩增仍然存在，无论15个循环还是35个循环都无关紧要；我们仍然能凭此检测到靶标分子，因此这比其他任何方式都要准确得多。”Meredith Raith正在操作微滴式数字PCR(ddPCR)系统的微滴发生器。SCCWRP的高级微生物学家Yiping Cao博士利用ddPCR的特性实现对目标基因的绝对定量，多重检测不同病原体，最小化环境样品中的化学物质对反应的抑制作用。随着Cao博士对ddPCR技术了解的增多，她意识到她可以同时检测肠球菌和人排泄物相关的拟杆菌，这样的双重反应是她在qPCR上由于试剂的竞争而未能成功实现的。

“在ddPCR上，你可以使用非常小的反应体系，”她解释道，“试剂竞争被局限在微滴中并最小化，因此可以实现多重反应。”Cao博士可以在一个反应中同时检测两种关键的指示生物，节约了时间和试剂。Cao博士开发的一个双重ddPCR检测体系，同时检测肠球菌（蓝色通道）和人排泄物指示微生物（绿色通道）更快，更廉价的水质监测最近，Cao博士的初步成果已显示出了前景和希望，不仅可以提供更好的重复性，还能减小qPCR中抑制物对检测的不良影响。

通过对两种指示生物的双重检测，ddPCR检测体系的检测成本比qPCR明显降低。在各级环保机构必须克服预算紧缩的同时还要开展其保护公共卫生的职能的时期，这显得尤为重要。遗传分析手段使水质监测机构可在数小时内获知风险而无需一整天的细菌培养。ddPCR进一步提升了检测方法，提供更准确的多重靶标基因检测手段，并具有分析新的遗传标志物以及更好地追踪污染源的潜力。Cao博士已经开始着手向她同僚们展示演示她的双重ddPCR检测体系并组织数据用于发表。通过进一步的验证，她希望这个检测方法能为水质评估应用领域，特别是排泄物源头的认定，提供又一种有效手段。

“我们计划培训我们的那些对该项新技术感兴趣的成员机构，”她说，“我们希望ddPCR的方法能成为一个有价值的工具，为环境监测机构或研究人员提供更准确、更具重复性的检测结果。”

然而，双重检测并不是ddPCR唯一的应用，“这是面向未来的技术，打开了通向各种科学问题的大门，而这些问题是我们之前还不能回答的。”

Cao博士说。这些应用包括筛选其他的遗传标记物用以更好的找出含有害病原体的排泄物污染源，或者直接靶向检测致病微生物本身；更准确的检测排泄物来源的特异性标记物还能提高对源头的追踪能力，使水质监测先于污染整治。目前，ddPCR最直接的意义是能更快更好地为游泳者提供警示信息。“如果我们能在当天及时得到结果，那真的是很有意义的事情，”John Griffith说，“事实上我们想把这个（ddPCR）技术整合进一个移动监测平台，可将数据远距离发回实验室。该计划如果能成功，将为公共卫生工作提供更为明确且可操作的信息。”