Real-time PCR实验攻略

北京协和医学院阜外心血管病医院心外科心血管病国家重点实验室吴益和分享

实验中必须坚持的一些好习惯

1. 加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均。

2. 移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。

3. 所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因一. 防止RNA酶污染的措施。

一、防止RNA酶污染的措施

1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180 ℃的高温下干烤6 h或更长时间。

2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。

3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10 min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。

4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37 ℃处理12 h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22 μm滤膜过滤除菌。

5. 操作人员戴一次性口罩. 帽子. 手套，实验过程中手套要勤换。

6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

动植物总RNA提取-Trizol法

Trizol法适用于人类. 动物. 植物. 微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。

在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80 ℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

1. 将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100 mg组织加入1 ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10×106个细胞加1 ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞； 2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30 ℃下放置5分钟；然后以每1 mlTrizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。 在室温下（15 ℃～30 ℃）放置2～3分钟后，12 000 g（2 ℃～8 ℃）离心15分钟； 3. 取上层水相（离心后，混合物将分离为底层为浅红的. 中层为酚-氯仿相. 上层为无色的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%）于一新的离心管，按每1 mlTrizol液加0.5 ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温（15 ℃～30 ℃）放置10分钟，12 000 g（2 ℃～8 ℃）离心10分钟。【如果希望分离DNA或蛋白质，保留中层和下层酚-氯仿相，有机相能保存在4°C一夜】

4. 弃去上清液（RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁），按每1 ml Trizol液加入至少1 ml的比例加入75%乙醇进行洗涤，涡旋混匀，4 ℃下7 500 g离心5分钟【RNA能够在-20 °C保存在75%乙醇中至少1年，4°C保存至少1周】

5. 小心弃去上清液，让沉淀的RNA在室温下自然干燥或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会使RNA失去溶解性，导致A260/280 ratio <1.6。

6. 加适量Rnase-free water 溶解RNA沉淀，用枪头反复吸取混匀，55-60 ℃水浴10-15 min。进行下游实验或-70 ℃保存备用。

7. RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70 ℃。

预计的总RNA产量：

[注意]

1. 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值 2. 加氯仿前的匀浆液可在-70 ℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4 ℃保存一周，-20 ℃保存一年。

总mRNA的提取(自己的经验)

一、关于Trizol Reagent需要的试剂

1. Chloroform：氯仿 (分析纯)

2. Isoproplyl alcohol：异丙醇(分析纯)

3. 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。

4. RNase-free water：无Rnase的水。方法是：将DEPC按0.01%（V/V）加在dH2O中500 ml（50 ul），在37 ℃过夜，并高压灭菌即得（150 ℃ 3小时）

5. 一次性塑料手套

6. 注意：DEPC有致癌之嫌

7. 抽提出的细胞总RNA干燥后加水50 ul，取10 ul加无Rnase水990 ul，稀释100倍成1 ml。于0.5 cm厚的石英比色杯中，以无Rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：A260/280 ratio <1.6。

8. 分离组织10 mg（纯组织）加800 ul Trizol试剂。

二、DEPC处理方法如下

1. DEPC处理 （1）DEPC水：100 ml超纯水加入0.2 ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。 （2） Tip头(枪头）. EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1 ml. 200 μl. 20 μl Tip头；EP管和PCR反应管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加入1ml DEPC）37 ℃浸泡过夜，高压灭菌。

2. 提取RNA，用DEPC水溶解

3. RT 我是用PCR仪来控制温度和时间的，所以RT是在PCR反应管中作的。

4. 操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。 最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下，枪头盒插好枪头后，加入1-2 ml的0.1%DEPC水，再灭菌就行了；现在有进口的RNASE FREE的枪头买，直接用不用处理的。