PCR-DGGE操作步骤

变性梯度凝胶电泳DGGE操作步骤：

1、将海绵垫固定在制胶架上，把类似‘三明治’结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。

2、共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15.5cm，短的那根长9cm。将短的那根与Y形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在3、在两个注射器上分别标记‘高浓度’与‘低浓度’，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置。

4、反时针方向旋转凸轮到起始位置。为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。例如16*16cmgels(1mmthick)：设体积调整装置到5、配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。

6、每管加入80μl10%APS，迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。用连有聚乙烯管标有‘

高浓度’的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶操作同上。

7、通过推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器，推动溶液到聚丙烯管的末端。注意不要将胶液推出管外，因为这样会造成溶液的损失，导致最后凝胶体积不够。

8、分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确!再将注射器的聚丙烯管同9、轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，在这个步骤中最关键的是要保持恒定匀速且缓慢地推动凸轮，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板中。

10、小心插入梳子，让凝胶聚合大约一个小时。并把电泳控制装置打开，预热电泳缓冲液到60℃。

11、迅速清洗用完的设备。

12、聚合完毕后拔走梳子，将胶放入到电泳槽内，清洗点样孔，盖上温度控制装置使温度上升到60℃。

13、用注射针点样（预先准备好的活性污泥扩增产物，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化）。

14、电泳（200V，5h）。

15、电泳完毕后，先拨开一块玻璃板，然后将胶放入盘中。用去离子水冲洗，使胶和玻璃板脱离。

16、倒掉去离子水，加入固定液（10%乙醇,0.5%冰醋酸）中，放置17、倒掉固定液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入0.2%AgNO3,用之前加入。

18、倒掉银染液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入1.5%NaOH,0.5%甲醛）显色。

19、待条带出现后拍照。