PCR操作范例及反应体系的组成
一、PCR操作范例
在一个典型的PCR反应体系中需加入：适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg 2+ 和两个合成的DNA引物。模板DNa 94℃变性1min，引物与模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循环前模板预变性3～5min；在末次循环后，样品仍需继续延伸3～5min以上，确保扩增的DNA为双链DNA。为便于了解PCR反应中各成份的组成，加入量和反应条件，使人们以此为基础，对不同的研究对象逐项改变来找到最佳反应条件，特列举Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA 试剂 盒提供的典型反应条件供参考。
表22-1 PCR反应混合液
成分 | 加入体积（μl） | 最终浓度 |
双 蒸馏 水 | 53.5 | |
10×反应缓冲液 [1] | 10.0 | [1×]Mg 2+ 1.5mmol/l K + 50mmol/L |
4×dNTPs(各1.25mmol/L) | 16.0 | 各200μmol/L |
λ-DNA模板（全长48.5kD） | 10.0 | 1ng/次 |
引物1,2（各25bp,20μmol/L） [3,4] | 5.0 | 1.0μmol/L（100pmol） |
Taq聚合酶储存液 [2] | 0.5 | 2U/100μl |
总体积（pH8.3） | 100.0 | |
石蜡油 | 50～100.0 |
扩增条件：94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25～30个循环。
注：[1]反应缓冲液[10×]含：100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),
15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl 2 ,
0.01%(W/V)明胶（Sigma G2500）
[2]酶储存缓冲液（-20℃）含：50%甘油，100mmol/l KCl,
20mmol/L Tris-HCl ph8.0
0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT
200μg/ml明胶
0.5%吐温20，0.5% Nonidet P40
[3][4]引物，1，2：扩增λ-噬菌体基因中500bp的片段
引物1序列：7131～7155（5’）-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)
引物2序列：7606～7630（5’）-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)
注意（3’）端有2个bp互补故易生成50bp的双体
二、PCR反应系统的组成
（一）PCR缓冲液（PCr Buffer）
用于PCR的标准缓冲液见PCR操作范例。于72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg 2+ 优于Mn 2+ ，而Ca 2+ 无任何作用。
1．Mg 2+ 浓度Mg 2+ 的最佳浓度为1.5mmol/L(当各种dNTP浓度为200mmol/L时)，但并非对任何一种模板与引物的结合都是最佳的。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg 2+ 浓度调到最佳，其浓度变化范围为1～10mmol/L。Mg 2+ 过量易生成非特异性扩增产物，Mg 2+ 不足易使产量降低。
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