实时定量PCR技术综述

1.PCR反应动力学 右图为PCR反应曲线（横坐标为循环数，纵坐标表征产物量），不同的曲线代表初始模板量不同的 PCR反应。PCR反应的动力学公式为： C n =C 0 (1+E) n 其中C 0 和C n 分别为初始模板和n循环的拷贝数，n为循环数，E为扩增效率（0≤E≤1），理想状态下（即每个循环中所有模板均与引物结合并等到扩增），E为1。

由上图可知，只有在线性区段E值才为定值，这样才能通过检测C n 定量C 0 ，由于终点检测不能保证在线性区段，所以重复性不好，实时检测（每个循环检测一次）技术解决了这个问题。 2.定量PCR原理 定量PCR是将待测标本与一系列浓度（C 0 ）已知的标准品在同一条件下共同扩增，并进行实时检测，根据标准品的检测值及已知的C 0 值作出标准曲线，如右图（横作标为的C 0 对数值），再根据待测标本的检测值在标准曲线上查到待测标本的C 0 值。 3.信号产生 目前定量PCR技术信号产生都是基于FRET (fluorescence resonance energy transfer)的原理，即在一定波长的光激发下，一个荧光基团A发光，并且被邻近的另一个荧光基团B吸收，使荧光基团B发光。如检测荧光基团A，应在FRET消除后；如检测B，则应在FRET发生时检测。 根据信号产生方式的不同可将定量PCR技术分为三类：TaqMan Probes技术；Hybridization Probes技术；Molecular Beacons技术。 TaqMan Probes技术（右图A）是Perkin Elmer公司1995年研制，利用热稳定DNA聚合酶5’→3’外切酶活性，将TaqMan 探针5’端荧光基团切去，使之与3’端荧光基团分离、荧光淬灭消失，在特定波长下检测5’端荧光基团即可表征PCR产物的量。

Hybridization Probes技术（右图B）是Roche公司建立的，PCR反应退火过程中，两个探针与模板杂交（相邻一个碱基），发生FRET，这时检测第二个荧光基团即可表征PCR产物的量。Hybridization Probes技术要求热稳定DNA聚合酶不具备5’→3’外切酶活性，而是在引物延伸过程中被取代，使探针可在下一循环再与模板杂交，如探针被降解，可导致定量不准。

Molecular Beacons技术（上图C）利用茎环结构的探针，当形成茎环结构时，发生荧光淬灭，退火过程中，探针与模板杂交，荧光淬灭消失，在特定波长下检测5’端荧光基团即可表征PCR产物的量。