实时定量PCR应用中的问题和优化方案

实时定量PCR的应用现状 实时定量PCR技术自1996年诞生以来，由于它显著的优越性，不仅广泛的应用于分子生物学的各个研究领域，而且也开始作为一种诊断手段应用于临床。其应用涉及到的范围包括DNA、mRNA和病毒荷载量的定量，核酸多态性分析，基因突变分析等多个领域[3]。 Giulietti 等人[6]对用实时定量PCR测定细胞因子基因的表达作了详细的描述。细胞因子是一种调节蛋白，它对免疫反应、炎症反应具有重要的调节作用，其量的改变常常与一些疾病，如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的关系。由于所得到组织样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平的检测，另外，通常用的蛋白质检测方法（如ELISA）的灵敏度也难以完成对极微量的蛋白产物的检测，所以应用PCR定量进行基因诊断就显得十分有意义。 众所周知，cDNA微排列和差异表达PCR技术是对基因表达变化分析的两种关键技术，但是这两种技术只能对基因表达变化进行定性分析，而不能进行定量分析。Rajeevan等人[7]利用实时定量PCR技术却成功地将基因表达的变化进行了量化，不仅有效地证明了上述两种方法的有效性，而且提供了一种具有高通量的对基因表达变化进行检测的新技术。 实时定量PCR技术的出现不仅增强了有关对基因量变化的研究方法，而且也增强了对基因质所发生变化方面的研究。例如Laird和他的同事们[8]建立了一种被称作Methylight的实时定量PCR方法，它能通过特异的引物和/或Taqman探针检测基因CpG岛的胞嘧啶是否发生了甲基化。由于实时PCR的敏感性和特异性，使得这种方法对胞嘧啶的过度甲基化常常具有极高的灵敏度。最近有研究表明这种方法可以从食管癌病人的食管粘膜中检出含有发生了过度甲基化基因的细胞[9]。又如Sevall等人[10]证明可以用实时定量PCR方法区分含有突变的等位基因。这是利用两种不同的荧光报告基团标记Taqman探针，该探针既可同野生型基因又可同突变型基因发生杂交，由于探针的杂交效率及随后的切割是由杂交决定的，所以如果出现一种信号强于另一种信号则表明两条基因具有同源性，若两种信号都增强则表明为异源性。 目前实时定量PCR在临床诊断方面的应用主要体现在对感染组织或细胞负载病毒的定量测定上，这一技术对DNA和RNA病毒都可以检测，目前已有标准的操作手册供人们使用，但是必须明确，国际上既没有统一的病毒荷载的标准，也存在着对其标准曲线和定量准确性的各种争论。这里值得一提的是一种称为NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）的技术[11]，它是一种利用电化学以光的等温PCR反应，在反应过程中能产生一种与靶RNA反极性的RNA扩增子，分子beacon常用于这种技术 ，这种方法常常用于对逆转录病毒的定量测定。 常用的热循环仪 对PCR产物进行实时定量的测定之所以能成为现实，并且应用如此广泛，其中一个重要的原因就是新的热循环仪的研制与推广。目前，国内外常用的热循环仪主要有以下几种： 1. PE公司生产的Applied Biosystem系列：(1) ABI Prism 7700 Sequence Detection System (SDS)是第一种作为商业用途的实时PCR测定仪，它由激光激发荧光，并且可在500-660nm范围内调节波长，可以用于基于水解探针、双链DNA结合染料、分子beacon原理的分析。一次可以测定96个样本，并且速度较快，一批样本的完成只耍要2小时。但是它不能实时对扩增结果进行分析，而只能在全部扩增结束后才进行数据分析。(2) Gene Amp 5700 SDS: 它的基本工作原理和操作与 ABI Prism 7700 SDS相同，但是它是利用卤素灯为激发光源，而且只设计了一个检测波长。(3) ABI Prism 7900 SDS: 这是一种为实现高通量检测而设计的 仪器 ，其基本构成与ABI Prism 7700 SDS相同，但程序设计完全实现自动化要求，而且有两种样品盘可供选择（96孔和384孔）。如果加上一个装载辅件，可以在24h之内完成84个384孔板的样本测定。