聚合酶链反应（polymeras chain reaction，PCR）

聚合酶链反应（polymeras chain reaction，简称PCR）是体外特异性扩增DNA分子的一项技术。它是美国Cetus公司人类遗传学研究室的科学家Kary.B.Mullis在1985年发明的。Mullis等在建立PCR方法初期，仅采用非常简单的三种温度的水浴进行实验，应用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段催化复性引物的延伸反应。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq酶）引入PCR；随着自动化扩增仪的发明和发展 PCR技术得到极大的推广应用，近年更是迅速渗透到生命科学的各个领域，成为分子生物学最重要的技术之一。 PCR主要用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段，其特异性主要由人工合成的与待扩增的DNA片段两条链两端已知序列分别互补的一对寡核苷酸引物决定。PCR反应体系由引物、微量的DNA模板，四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）溶液，耐热Taq DNA聚合酶，Mg 2+ 及适量的缓冲液等组成。反应时首先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为复性或退火；再将温度升至中温，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5′→3′方向延伸，合成新的DNA片段，该片段又可作下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。   从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增10 6 ～10 9 倍。如此大量扩增的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳即可得以检测分析，另外PCR产物还可用于核酸探针杂交、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析等。 由于该法操作简单，实用性强，特异性和灵敏度高，并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究、以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等的基因诊断和研究中得到广泛应用。   一、实验目的 1．掌握PCR技术的基本原理； 2．了解应用PCR技术检测性别决定基因的基本过程。   二、实验原理 SRY基因位于人类Y染色体，是1990年Sinclair等克隆的睾丸决定基因，X染色体上没有相应的同源节段。根据SRY基因序列合成一对特异性引物，通过PCR反应检查患者有无此基因相应扩增片段，以及患者的表型可对患者的真正性别和病因作出判断，另外对胎儿性别的产前诊断有利于防止性连锁遗传病患儿的出生。   三、实验准备 （一）材料 人体静脉血、注射器、微量加样器及吸头、1.5ml及0.5ml Eppendorf管。 引物序列： SRY1：5′-GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTG-3′ SRY2：5′-CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTG-3′