AFLP-PCR简介

概述

AFLP（amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）是由荷兰科学家Pieter Vos等于1995年发明的分子标记技术。

文章发表于《Nucleic Acids Research》Vol.23。AFLP是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。

它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记。

AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段。所以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。

AFLP技术原理

AFLP技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。

使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。

扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性[5]。Vos等（1995）曾对AFLP的反应原理进行了验证，结果检测到的酶切片段数与预测到的酶切片段数完全一致，充分证明了AFLP技术原理的可靠性。

进行AFLP分析时，一般应用两种限制性内切酶在适宜的缓冲系统中对基因组DNA进行酶切，一种为低频剪切酶，识别位点为六碱基的rare cutter；另一种为高频剪切酶，识别位点为四碱基的frequent cutter。

双酶切产生的DNA片段长度一般小于500 bp，在AFLP反应中可被优先扩增，扩增产物可被很好地分离，因此一般多采用稀有切点限制性内切酶与多切点限制性内切酶相搭配使用的双酶切。目前常用的两种酶是4个识别位点的Mse I和6个识别位点的EcoR I。

AFLP接头和引物都是由人工合成的双链核苷酸序列。接头（Artificial adapter）一般长14～18个碱基对，由一个核心序列（Core sequence）和一个酶专化序列（Enzyme-specific sequence）组成。常用的多为EcoR I和Mse I接头，接头和与接头相邻的酶切片段的碱基序列是引物的结合位点。AFLP引物包括三部分：5′端的与人工接头序列互补的核心序列（core sequence，CORE），限制性内切酶特定序列（enzyme-specific sequence，ENZ）和3′端的带有选择性碱基的粘性末（selective extension，EXT）。

AFLP反应流程

AFLP反应程序主要包括模板DNA制备，酶切片段扩增及凝胶电泳分析这3个基本步骤。各步骤具体的过程有：

1. 首先要制备高分子量（HMW）基因组DNA，选择6个碱基识别位点的限制性内切酶（通常是EcoRI或PstI或SacI）。

2. 酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。

3. DNA片段的预扩增。

4. 在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。

5. PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。

6. 多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。

7. Genomic AFLP。

8. cDNA-AFLP。

AFLP技术的应用

AFLP具有可靠性好，重复性强，可信度高等优点，近年来广泛应用于遗传育种研究，在动物遗传育种、动物基因组研究中有着广泛的应用前景。如：

1. 构建遗传连锁图谱。

2. 利用AFLP快速鉴别与目的基因紧密连锁的分子标记。

3. AFLP辅助的轮回选择育种。

4. 利用AFLP技术研究基因表达与调控。

5. 分类和进化研究。

6. 甲基化研究。

AFLP 技术主要特点

（1）分析所需 DNA 量少，仅需 0.5 μg。也可以用作于线粒体 DNA。从线粒体中得到RFLP 研究所需的几十到上百μg 的 DNA 是很困难的。Roseudahl 和 Taylor（1997） 成功地从一种真菌（Mycorrhizal fungi） 的单个孢子中得到 AFLP 标记，而每个单孢子仅产生约0.1～0.5 μg DNA。另外，AFLP 反应对模板浓度的变化不敏感，DNA 浓度在 1000 倍的范围内变化时对反应的影响都不太大，所产生的指纹图谱十分相似。

（2）可重复性好。AFLP分析基于电泳条带的有或无，高质量的DNA和过量的酶可以克服因DNA酶切不完全而产生的失真，PCR中较高的退火温度和较长的引物可将扩增中的错误减少到最低限度，因而AFLP分析具有很强的可重复性。Jones等（1997）在欧洲8个实验室使用共同的样本，进行严格的实验，将得到的DNA图谱进行比较，172条谱带中仅一条出错，误差小于0.6% 。

（3）多态性强。AFLP 分析可以通过改变限制性内切酶和选择性碱基的种类与数目，来调节扩增的条带数，具有较强的多态分辨能力。设计不同的人工接头就会相应地产生不同的 AFLP 引物，引物 3'端的选择性碱基数目可以是 2+2， 2+3 也可以是 3+3，这些碱基的组成也是多种多样的。由于 AFLP 引物设计的巧妙与搭配的灵活，使得 AFLP 能产生的标记数目是无限的。迄今为止，每个 AFLP 反应能检出多态片段之多，信息量之大，效率之高是其它任何一种分子标记所无法比拟的。

（4）分辨率高。AFLP 扩增片段短，适合于变性序列凝胶上电泳分离，因此片段多态性检出率高，而 RFLP 片段相对较大，内部多态性往往被掩盖。

（5）不需要 Southern 杂交，无放射性危害，且不需要预先知道被分析基因组 DNA的序列信息，是一种半随机的 PCR。

（6）样品适用性广。AFLP 技术适用于任何来源和各种复杂度的DNA ，如基因组山东农业大学博士学位论文29DNA、cDNA、质粒、某一个基因或基因片段，且不需要预知这些DNA 的序列特征。用同样一套限制酶、接头和引物，可对各种生物的DNA 进行分子遗传标记研究。

（7）稳定的遗传性 AFLP 标记在后代中的遗传和分离中符合Mendel式遗传规律，种群中的 AFLP 标记位点遵循 Hardy－Weinberg 平衡总之，在技术特点上，AFLP 实际上是 RAPD 和 RFLP 相结合的一种产物。它既克服了 RFLP 技术复杂、有放射性危害和 RAPD稳定性差，标记呈现隐性遗传的缺点；同时又兼有二者之长。近几年来，人们不断将这一技术完善、发展，使得 AFLP 迅速成为迄今为止最有效的分子标记。