pcr技术应用论文：荧光定量PCR技术在肿瘤研究中的应用

陈文学 邹学森 陈岳青 黄秀珍 钟礼瀑 （江西省肿瘤医院 肿瘤研究所， 江西 南昌 330029） [摘要] 荧光定量PCR技术具有简便、灵敏、准确等优点，目前已经在乙肝和性病的诊断和治疗中得到了广泛的应用，但在肿瘤方面的应用还处在研究和开发阶段。本文综述近年国内外相关荧光定量PCR技术在肿瘤研究中的应用。 [关键词] FQ-PCR；肿瘤；人乳头瘤病毒；EB病毒 肿瘤是危害人类健康的一种疾病，它的恶性程度与预后判断主要依靠是否有转移和病理切片分期。随着分子生物学的迅猛发展，肿瘤研究领域的大量研究成果显示，肿瘤的发生、发展、治疗和预后与肿瘤细胞内部基因和肿瘤相关病毒有关。本文综述了荧光定量PCR技术的原理及其在肿瘤研究中的应用。 1.单管荧光定量PCR技术的原理 单管荧光定量PCR（fluorogenic quantitative PCR, FQ PCR）的反应体系中除了普通PCR所需的引物外，还有一条荧光探针，探针的5`端标记了荧光报告基团，3`端标记了荧光淬灭基团，当这条探针保持完整时，荧光淬灭基团抑制荧光报告基团发出荧光。PCR反应开始后，随着DNA链的延伸，Taq酶的5`-3`外切酶活性将荧光探针切断，荧光淬灭基团的作用消失，荧光报告基团就发出了荧光信号，荧光信号的强弱与PCR的产物数量成正比，根据测量到的荧光信号强弱，通过分析软件得到样本的原始拷贝数。 2. FQ―PCR的优点 FQ―PCR技术是融合了PCR技术与DNA探针杂交技术的优点，实验的整个过程只在加样时打开1次反应管，在PCR的每个循环中可以直接监测到荧光信号的变化，根据PCR反应酶动力学特点分析软件会自动对DNA进行定量，因此也有人称FQ-PCR为实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR）。其优点为：①FQ-PCR解决了传统PCR技术不能定量和扩增产物污染的问题。②避免了普通定量PCR操作过程中的污染，FQ-PCR只在加样时打开反应管1次。③FQ-PCR操作简便、快捷、结果准确，不需要普通PCR扩增后进行电泳或放射自显影观察结果，方便了临床上应用。④FQ-PCR可以对每一批扩增样本进行扩增效率的评价。对DNA做系列稀释，每个稀释浓度的DNA对数值与其Ct值做回归分析，PCR的扩增效率的计算方法为：效率=10-1/斜率。通过计算扩增效率可以对仪器、操作人员和试剂进行综合评定。 3. FQ-PCR在血液系统肿瘤中的应用 Jones CD（1）对FQ-PCR技术预测慢性髓性白血病（CML）病人的髓外增的有效性进行了评价。FQ-PCR方法检测372例临床标本和50例外周血标本p210和 p190 bcr-abl RNA 融合基因的转录水平，用看家基因对结果进行标准化，检测结果为特异性100%。敏感性研究显示，细胞系稀释到0.0001%时仍然可以检测到bcr-abl，重复性实验显示组间变异系数（CV）为12.3%，组内变异系数为13.8。实验结果显示FQ-PCR是一种非常可靠的监测bcr/abl阳性CML病人的方法。 荧光原位杂交（FISH）的结果显示10%-15%的CML病人bcr-abl杂合子缺失，这样的病人预后非常差。FQ-PCR方法可以鉴定CML病人杂合子亚单位上的微小缺失，这种微小的缺失难于用FISH方法分辨出来。Kolomietz（2）用FQ-PCR方法对25例预后差的病人进行检测，18例无微小缺失CML病人获相对较好的治疗效果。 Hughes等（3）将1106例CML病人随机分为imatinib(蛋白激酶抑制剂)治疗组和INF-a+卡铂治疗组，用FQ-PCR检测2个治疗组病人血液中bcr-abl的转录水平，结果显示imatinib治疗组12个月后bcr-abl的转录水平降低了3个数量级，治疗效果明显优于INF-a+卡铂治疗组。CML病人bcr/abl的转录水平降低了3个数量级或无转录者，预后较好。 4. FQ-PCR在乳腺癌中的应用 Weigelt等（4）用FQ-PCR方法检测94例乳腺癌转移的病人外周血CK19、p1B、PS2 和 EGP2的mRNA水平，通过QDA将4个基因综合成一个评价指标。在77例乳腺癌骨转移的病例中发现QDA阴性病人的存活率明显高于QDA阳性病人(P=0.015 、0.0053)，QDA阳性的病人1年存活率为3%，2年的总存活率为17%，而QDA阴性的病人存活率为36%。 ANG1 和ANG2是肿瘤细胞分泌的促进肿瘤细胞生长和转移的因子，Sfiligoi（5）研究了ANG与肿瘤细胞淋巴结转移和肿瘤病人的生存率之间的关系。38例乳腺癌活检标本提取mRNA,用FQ-PCR技术测定ANG1 和ANG2基因水平，检测结果与临床病理和临床生化指标相比较，发现ANG2与腋窝淋巴结转移有高度的相关性，单变量和多变量生存分析显示，ANG2 mRNA 水平与疾病（p < 0.0001）、总存活率(p < 0.0003)呈单因素高度相关性。 5. FQ-PCR在胃肠道肿瘤中的应用 胃癌手术后的腹膜播散是胃癌复发的常见原因。Ueno（6）对124例胃癌手术病人实施腹腔灌洗，FQ-PCR技术检测灌洗液中CEA水平，结果显示CEA的Ct值与肿瘤的侵犯深度、淋巴结的转移、血管转移、肿瘤分期、存活率有高度的相关性。CEA的Ct值预测肿瘤腹膜转移的敏感性为76.9%，特异性为67.7%，而细胞学检测的敏感性只有23.1%。这些实验数据显示，FQ-PCR技术检测灌洗液中CEA水平，对预后和诊断是否有腹膜转移是一个很好的指标。 alpha4GnT是一种糖苷转移酶，它只存在于胃癌细胞中，外周血中检测不到。Shimizu（7）对37例胃癌病人和23名健康人外周血alpha4GnT的mRNA进行荧光定量检测，胃癌病人的检出率为62.2%，而健康人未检测出阳性。令人振奋的是有5例早期胃癌病人，胃癌侵犯只局限在粘膜层，alpha4GnT的mRNA的检出率达到80%。慢性胃炎、胃幽门螺杆菌感染的良性病变的alpha4GnT mRNA水平明显低于胃癌病人。这些结果表明定量检测外周血中alpha4GnT的mRNA是对胃癌的一个很好的检测指标。 肝癌的早期发现对肝癌的治疗和预后非常重要，Chuma（8）对7个早期肝癌结节和7个进展期肝癌结节的12 600个基因进行了定量分析，发现95个基因可以区分早期肝癌和正常组织，92个基因可以区分早期肝癌和进展期肝癌，其中热休克蛋白70基因（HSP70）在早期肝癌结节中明显上调，与癌前病变组织、正常组织存在明显差异（p<0.001）。 6. FQ-PCR在其它肿瘤中的应用 Gelmini（9）用FQ-PCR方法检测43例前列腺癌和16例前列腺良性增生病人的活检组织PSA，前列腺癌病人的PSA mRNA水平变异非常大，平均2.5 x 107（ 2 x 104 - 2.1 x 108 ）/ml，而良性增生肿瘤组织的平均拷贝数为1.3 x 106/ml,前者的表达水平明显高于后者(p = 0.006)，但是前列腺癌组织的PSA mRNA水平与外周血中PSA mRNA水平无相关性。Straub（10）用高灵敏度的FQ-PCR方法检测了129例前列腺癌根治术前后和19例前列腺良性增生的血标本中PSA mRNA水平，发现血浆中的PSA mRNA水平可以反映外周血中前列腺癌细胞的数量，对病人早期治疗和手术后病情监测及预后有一定帮助。 Survivin 是一种凋亡抑制蛋白，在非小细胞肺癌（NSCLC）早期呈现过度表达。Falleni[11]对86例NSCLC病人（IA and IB）定量检测Survivin mRNA水平，结果80例（96%）病人检测出Survivin mRNA表达，明显高于正常肺组织 (p = 0.008)，并且鳞状细胞癌的表达水平高于其它类型肿瘤(p = 0.0022)，FQ-PCR技术是对肺癌早期诊断的一种有效手段。 最近又有文献报道将FQ-PCR技术应用到头颈肿瘤（12）、口腔肿瘤（13）、淋巴瘤[14]等肿瘤中，得到了较好的检测结果。 7. 肿瘤相关病毒的检测 人乳头瘤病毒（HPV）是宫颈癌的主要诱发因素，已经证实宫颈癌组织与正常组织的HPV早期基因（E7）的表达水平有显著差异，Lamarcq等（15）用FQ-PCR方法探讨宫颈脱落细胞E7基因的转录水平是否可以诊断早期宫颈癌，结果显示在高分化SIL中HPV16或HPV18的E7基因的检出率为47%，正常组织未检测到，两者存在显著差异（p<0.006）,此项实验也证明E7基因可以作为宫颈癌早期筛查的指标。Dong SM等[16]对175例宫颈浸润癌，57例宫颈原位癌，60例正常对照的血浆进行传统PCR方法与FQ-PCR方法扩增HPV基因进行比较，传统方法浸润性宫颈癌的检出率为6.9%， 原位癌的检出率为 1.8%, 正常组织的检出率为1.7% ，FQ-PCR方法对浸润性宫颈癌的平均拷贝数为11163拷贝/ml,原位癌的拷贝数为8拷贝/ml，正常组织拷贝数为0，FQ-PCR方法明显优于传统PCR方法。 早期鼻咽癌可以通过放射治疗进行根治，中晚期鼻咽癌有较高的复发率。Dong（17）对170例没有转移的鼻咽癌实施统一的放射治疗方案，在治疗前和治疗后6-8周用FQ-PCR方法检测血浆中EB病毒的含量，治疗后EB病毒的含量与鼻咽癌的总存活率有高度相关性（p<0.001）,对鼻咽癌复发的阳性和阴性预测值分别为87%和83%。鼻咽癌治疗后EB病毒的含量可以准确反映治疗后肿瘤的残余水平，与肿瘤病人的存活率有高度相关性。 8. 肿瘤多药耐药基因检测 肿瘤的多药耐药基因的出现使许多肿瘤患者治疗失败，以往用流式细胞仪或者免疫组化的方法检测p糖蛋白（多药耐药蛋白）是否表达，或者用PCR的方法检测mRNA,这些方法都很难实现标准化的操作和统一判断标准。FQ-PCR方法可以实现标准化的操作，并且可以直接定量出多药耐药基因（MDR）的拷贝数。Burger等（18）对59例原发性乳腺癌，以化疗为系统治疗的病人，进行了BCRP、LRP、MRP1、MRP2和MDR1基因的mRNA定量测定，结果为对化疗中度反应的病人5种基因的mRNA水平明显低于对化疗没有反应的病人。其中MDR1基因高表达组的病例分期明显低于MDR1基因低表达组（p<0.005），而且预后差。其它4种基因也存在同样差异，但是没有明显的相关性。Tseng（19）对50对正常与头颈癌组织的MDR1 mRAN研究中发现，27例T/N>1的标本中IV、III、II和 I期的MDR1分布为59.3%、22.2%、14.8%和3.7%，MDR1水平与肿瘤标本的分期有高度相关性 (P<0.01)，FQ-PCR方法对MDR1基因的检测可以辅助病理分期，指导临床治疗。 9. 结语 FQ-PCR是在临床上广泛应用的一种基因定量检测技术，它不但能够准确定量肿瘤相关基因的表达，还可以对外周血中肿瘤标志物进行准确定量，据此可以对肿瘤早期诊断与肿瘤分期、分型，以及实现对肿瘤转移的早期发现及预后判断。因此FQ-PCR技术在临床上将有更加广阔的应用前景。 参考文献 [1] Jones CD, Yeung C, Zehnder JL, et al. 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