PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)

问题1：无扩增产物

现象：正对照有条带，而样品则无

原因:

1、模板:含有抑制物，含量低

2、Buffer对样品不合适

3、引物设计不当或者发生降解

4、反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

对策:

1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量

2、更换Buffer或调整浓度

3、重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物

4、降低退火温度、延长延伸时间

问题2：非特异性扩增

现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带

原因：

1、引物特异性差

2、模板或引物浓度过高

3、酶量过多

4、Mg2+浓度偏高

5、退火温度偏低

6、循环次数过多

对策：

1、重新设计引物或者使用巢式PCR

2、适当降低模板或引物浓度

3、适当减少酶量

4、降低镁离子浓度

5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法

6、减少循环次数

问题3：拖尾

现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因：

1、模板不纯

2、Buffer不合适

3、退火温度偏低

4、酶量过多

5、dNTP、Mg 2+浓度偏高

6、循环次数过多

对策：

1、纯化模板

2、更换Buffer

3、适当提高退火温度

4、适量用酶

5、适当降低dNTP和镁离子的浓度

6、减少循环次数

问题4：假阳性

现象：空白对照出现目的扩增产物

原因：

靶序列或扩增产物的交叉污染

对策：

1、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；

2、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。