试管婴儿植入前遗传学诊断单细胞PCR的方法

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)简称PCR技术，是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于其可使特定DNA片段在数量上呈指数增加至可检测范围，故成为基因诊断的重要方法。

在PCR基础上衍生的一些扩增技术已用于基因突变的诊断。目前单基因疾病PGD所用的方法主要是基于PCR技术通过检测单细胞靶基因的数目及结构有无异常加以诊断。

聚合酶链式反应

PCR实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。

基本原理是：用一对寡核苷酸链做引物，引导DNA聚合酶在引物识别位点之间两条互补链上进行DNA合成，经过模板变性、退火及延伸三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，多次循环可使特定DNA片段在数量上呈指数增加至2×l0(6一7)拷贝。

单细胞PCR无需抽提DNA，经过变性前处理步骤后，即进行PCR循环反应。与经典PCR相比，其优点是无需制备DNA，节省时间，从获得样本、PCR反应到出结果只需几个小时左右。但由于单细胞PCR的模板量极低，仅1–2拷贝，故PCR体系必须具备下列条件：

①对模板扩增的忠实性好；

②方法稳定；

③无非特异性扩增；

④扩增的灵敏度高。目前用于PGD的PCR方法主要有以下几种：

1．巢式PCR

由于单细胞中可检测的仅l一2个拷贝的基因序列。

为了既不影响特异性又获得较大的敏感性，巢式引物被应用。巢式PCR设置二步PCR，只有初级PCR中特异的扩增片段才可能被二级引物扩增，可减少引物与模板非特异性位点的复性、引物二聚体的形成以及非特异背景产物的产生，从而提高了扩增特异性，而且增加了最终产物量。

2．多重PCR

如果与疾病相关的基因十分庞大，如杜氏肌营养不良症(DMD)，有2000多kb长。这些基因常多处发生缺失或突变，而且这些改变发生在相邻十至数百个kb的距离，超出了PCR技术所能扩增的有效长度，对此，可采用多重PCR，既在同一试管中加人多对引物，扩增同一模板的几个区域。目前报道多重PCR反应最多可同时扩增12条区带。

3．荧光PCR

指荧光标记的寡核苷酸引物。PCR产物用激光分析系统进行分析，从产物大小到核苷酸序列都能够被准确分析。由于不同的荧光分子在激光激发下有不同波长，在片段分析结构系统中，相同大小的不同产物可以被区分开。

其敏感性优于普通PCR千倍。准确性可达l一2bp。对于单细胞35–4O个循环就可以产生足够量的产物，不仅减少了散在的、非特异的污染，而且缩短诊断时间。现该方法已广泛用于PGD。

4．荧光定量PCR

该技术融汇了PCR和DNA探针杂交技术的优点，反应体系中，不仅有两条普通的引物，还有一条荧光标记探针。这条探针的5’和3’端分别标记了荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)。当探针保持完整时，无荧光发出。

PCR开始后，随着链的延伸，Taq酶将荧光探针切断，释放出荧光信号，且信号的强弱与PCR的产物数量成正比，检测出前者可计算出后者，从而获取DNA模板的准确结果。

该技术在完全闭管的情况下进行，无需凝胶电泳，通过特殊探头直接探测PCR过程中荧光信号的变化，解决了常规PCR不能定量及扩增产物污染而导致的假阳性、操作复杂等问题，减少污染的可能性，提高了诊断的效率。

5．原位PCR

此技术由HaSSe等于1990年建立，即在固定于同一载玻片上的同一个单细胞上，先用PCR原位扩增，再用FISt{检测，目前PGD中应用该方法，PCR的有效率为65％，FISI–I达85％。遗憾的是ADO较常规PCR高。

但这种新方法有效的把原位杂交技术的细胞定位能力与PCR扩增的所有潜在敏感性结合起来，相信随着引物设计及荧光PCR与原位PCR有效的结合，其不足会得到克服，该方法也许会成为PGD的未来。

6．免疫PCR

是PCR法与酶联免疫吸附试验(ELISA)法的融合技术，利用了PCR的大量扩增能力和抗原抗体反应的特异性。

其原理是将目的基因的扩增产物用生物素标记，检测突变的特异性探针用地高辛标记，二者经变性退火处理后加到含抗生物素的酶标板内，通过显色来鉴定突变是否存在。根据显色深浅可做定量分析。该法已用于囊性纤维病基因突变的检测。

7．等位基因特异性扩增

在设计引物时，根据已知突变位点的特征，在引物3’端或中间设计一错配碱基，使之仅能与突变型或野生型基因互补，而只扩增相对应的突变型或野生型基因。主要用于点突变导致的遗传病的检测。其优点是只需一步PCR，而无需电泳和标记，摆脱了分子生物学方法中必经电泳的现象。

在相互竞争的突变型和野生型引物中，分别采用不同荧光染料标记扩增的DNA，可直接对扩增产物进行判读。另外使用具有特定酶切位点的内嵌引物，也可提高产物特异性和产量，DNA扩增后用酶切割，由酶切产物可明确是否有基因突变，该法已应用于单个精子的DNA分析。

8．全基因组扩增技术

PGD的难点之一是可检测的材料极为有限，通常仅l一2个卵裂球细胞，约15–30pg的基因组DNA，很难进行一个基因的多种突变或多位点基因的改变的基因分析。全基因组扩增技术建立和成熟对PGD的开展具有重要的意义。

主要有引物延伸前扩增和简并寡核苷酸引物PCR两种方法。它能够无选择偏移的扩增全部DNA序列，从理论上讲，任何基因都能从全基因组扩增产物中检测出，可用于多个突变位点的单基因病、多基因病的诊断及染色体组分析等。