PCR及RT-PCR之基础问题解答

1、问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。

可能原因：

1）RNA被降解

建议解决方法：

在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA；

在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；

如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。

2）RNA中包含逆转录抑制剂

建议解决方法：

通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。

逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。

将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。

3）多糖同RNA共沉淀

建议解决方法：

使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。

4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火

建议解决方法：

确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。

对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体。

确定GSP是反义序列。

5）起始RNA量不够

建议解决方法：

增加RNA量。

对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。

6）RNA模板二级结构太多

建议解决方法：

将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火。

提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。

注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。

注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。

如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。

7）引物或模板对残余的RNA模板敏感

建议解决方法：

在PCR前用RNaseH处理。

8）靶序列在分析的组织中不表达

建议解决方法：

尝试其他靶序列或组织

9）PCR没有起作用

建议解决方法：

对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。