流式抗体滴定antibody titration步骤
很多小伙伴进入实验室后，都会或多或少的接触到流式实验，成为一个初级FLOWER看着师兄师姐动辄十几色的多色流式玩得轻车熟路，大数据分析信手拈来（什么tSNE图,
很多小伙伴进入实验室后，都会或多或少的接触到流式实验，成为一个初级FLOWER看着师兄师姐动辄十几色的多色流式玩得轻车熟路，大数据分析信手拈来（什么tSNE图,FlowSOM啊等等，简直不要太Perfect），收获老板连声夸赞
然而，一出手就让人看出来Non-professional的你，难道只能在组会上默默流下羡慕的泪水？
那么，为何不从今天开始打怪升级让我们从初级FLOWER变成老板的小骄傲呢？First，当我们购买到商业化的流式抗体后，（有些小伙伴可能还不会买抗体，别笑，你可能真不会买呢！买哪家的，怎么配色，怎么选克隆号等等，都有讲究。别慌，我们后续推文会你给购物指南哦）千万不要直接根据Instruction的Recommended usage 浓度直接染色啦Professional的你应该特别关注Recommended usage的最后一句It is recommended that the reagent be titrated for optimal performance for each application.图片来源：https://www.biolegend.com/因为推荐浓度一般是过饱和的，这带来了一定的抗体浪费，造成实验成本的增加但更重要的是,使用过量的抗体，也会大大提高非特异性染色，造成实验结果误差增加▲因此，为了更好的实验效果以及节省抗体的目的，抗体滴定实验，尤其在多色流式检测中就显得尤为重要就是通过倍比稀释的方法，设计不同的抗体体积梯度，检测抗体在你的实验条件下最优上样浓度（By the way,别人滴定的抗体浓度你可以直接拿来用吗？理论上如果你们染色的细胞类型相同，是可以用的）以BD公司的流式抗体为例：BD公司的流式抗体浓度一般为Concentration=0.2 mg/mL,推荐每个test检测用量为1 μg，那么最大用量即为5μL1. 准备6个1.5 mL EP管，在每个管中加入5 μL FACS buffer在1号管中加入5 μL抗体原液，混匀。换枪头，取5 μL加入下一个管中。以此类推。6号管中的最后5 μL弃去（细胞可以使用小鼠脾脏制备的PBMC，比较方便。但是最好用实验待检测的细胞滴定抗体，染色体积和细胞量也需一样）3. 4℃孵育30 min,1650 rpm离心5min，弃上清。加入200 μL FACS buffer重悬后加入PI，上机检测FACS buffer配方:在PBS中加入1% FBS和2 mM EDTA。4 ℃保存然而结果该怎样show出来呢？让老板赏心悦目的结果必然是一张美图，此时，我们就呈上一张美图！现在就打开FlowJo一起复现吧！
复现过程：
1. 打开FlowJo软件，将抗体滴定的若干个FCS数据文件拖入按照滴定抗体时的稀释比例由高到低放置FCS数据文件
3. 然后选择live cell，按ctrl+shift+E可选择同组中所有相同名称的行
4. 在File面板中，选择Export/Concatenate按钮下拉菜单Export/Concatenate Populations。填好你滴定抗体的名称（如CD8）后，点击concatenate
5. 点击右下角的Concatenate,新建一个NEW Workspace
6. 然后就能出图啦！打开新数据里面Live cell门事件，然后纵坐标选择CD8（本次滴定抗体名称）、横坐标选择SampleID，即可在一个散点图中展示各个滴定数据中CD8的分群变化了，一目了然看出滴定结果如上图所示：在我们的实验条件下选择1：4或1：8的抗体稀释比较为合适★小编个人经验：BD或Biolegend的CD3,CD4,CD8这三种流式抗体在100 μL /106体系下基本都是1：8的稀释比（小鼠脾脏，淋巴结，外周血，肿瘤组织等等都可以适用）
