PCR 基本原理

PCR实际上是通过引物延伸核酸的某个区域而进行重复双向DNA合成，是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法,其特异性由引物序列决定。

PCR扩增一个模板需要一对寡核苷酸引物、4种脱氧核糖核苷酸（4dNTP）、摩尔数超过dNTP的镁离子和进行DNA合成的耐热的DNA聚合酶。一般情况下，这两段寡核苷酸引物分别与模板DNA上待扩增DNA区段两侧的一段序列互补，并能进行特异性的结合。整个扩增过程包括如下三步：

1. 高温变性　基因组模板DNA加热至90℃～95℃，可使DNA双螺旋结构解链成单链。解链温度(Tm)即DNA双链离解至一半时的温度，对于低于20个碱基的引物，Tm值可以根据Tm=4（G+C）+2（A+T）计算（Suggs et al.1981）。由于DNA中G-C/A-T的比例不同，不同的DNA其Tm不同，G-C含量每增加1%，其解链温度可增加0.4℃。哺乳动物基因组DNA中G-C含量为40%～60%，因此，PCR的高温变性温度选择在90℃～95℃之间。

2. 低温退火　将反应混合物突然降温，引物与单链DNA模板(或从mRNA逆转录而来的cDNA)上的互补结合，形成模板-引物复合物。复性的温度决定于引物的Tm值，一般比Tm低5℃。

3. 中温延伸　按碱基互补原则从引物的5`端开始，沿着5` →3` 的方向，按照模板链上的序列合成新的DNA链。延伸的温度在60℃～72℃，延伸的时间则决定于扩增片段的长度。此时新链的合成速度非常快，每秒可延伸40～60个碱基。

经过上述变性-退火-延伸这样一个循环后，模板DNA拷贝数应增加一倍。延伸的产物在第二循环中经过变性后，亦与引物互补，并作为引物引导DNA合成的新模板。因此每经过一个循环，DNA拷贝数便增加一倍(×2)。n次循环后，拷贝数增加2n倍。进行30个循环，拷贝数即可扩增上百万倍。