M-MLV第一链cDNA合成试剂盒-技术手册
M-MLV第一链cDNA合成试剂盒-技术手册
一、 试剂盒组成
| Components | SK2027 | SK2028 |
| 5×M-MLV Reaction Buffer | 100µl | 250µl |
| dNTP Mix,10mmol/L | 25µl | 55µl |
| Oligo-p(dT)18 Primer, 0.5µg/µl | 25µl | 55µl |
| Random Primer p(dN)9 , 0.2µg/µl | 25µl | 55µl |
| RNase Inhibitor (a) , 40U/µl | 20µl | 50µl |
| M-MLV Reverse Transcriptase (b) (200U/µl) | 4000U | 10000U |
| RNase-free ddH2 O | 1ml | 1ml |
| Protocol | 1 | 1 |
(a) 1U RNase Inhibitor定义为能够抑制5ng RNase 50%活性的蛋白质量。避免反复冻融，使用时保持冰 浴。
(b) 1U M-MLV RT在37℃10分钟能将1nmol的脱氧核糖核酸变成为DE81可吸附形式。避免反复冻融，使用时保持冰浴。
(c) 试剂盒的各组成成分应在-20℃保存。
(d) 避免多次反复冻融RNA ，使RNA 保持在冰浴中处融化状态。
(e) 所有准备工作和实验步骤按《RNA 操作指南》操作。
二、试剂盒说明
1．试剂盒依赖逆转录酶（M-MLV RT），以RNA 为模板获得全长的第一链cDNA，其起始位点由所用引物所决定：
(1)随机九合引物[Random Primer p(dN)9 ]在RNA 模板上没有特异性结合位点，所有RNA 都可以做为第一链cDNA合成的模板；
(2) Oligo(dT)18 与poly(A)+ mRNA 的3’-末端互补，只有poly(A)+ mRNA 可作为cDNA合成的模板；
(3) 采用序列特异性引物以其结合位点为起始位点。
2．当第一链cDNA合成条件与PCR的条件能够兼容时，则本试剂盒的第一链cDNA合成产物可直接加入PCR反应混合物中进行反应。
3．第一链cDNA合成产物同样可经过处理后作为第二链合成的模板, 合成含各种标记的cDNA可以作为杂交实验的探针。
三、操作流程
1．在冰浴的试管中加入如下反应混合物：
(1) 模板RNA ：
| 总RNA | 1-5µg |
| 或poly(A)+ mRNA | 0.1-0.5µg |
| 或特异性RNA | 0.01pg-0.5µg |
(2) 引物：
| Oligo(dT)18 (0.5µg/µl) | 1µl |
| 或随机九合引物（0.2µg/µl） | 1µl |
| 或序列特异性引物 | 20pmol |
(3) 无RNA 酶去离子水（RNase-free ddH2 O）：定容至13µl。
2．轻轻混匀后，在70℃水浴5分钟后，冰浴30秒。
3．将试管冰浴，再加入如下组分：
| 5×Reaction Buffer | 4µl |
| RNase Inhibitor (40U/µl) | 1µl |
| dNTP Mix(10mmol/L) | 1µl |
4．轻轻混匀后离心3~5秒。加入1µl M-MLV RT（200U/µl），终体积为20µl。
6．反应混合物37℃水浴40~60分钟(如果采用随机九合引物则预先在25℃温育10分钟，然后37℃水浴40~60分钟)。
7．在70℃加热10分钟结束反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。
四、后续实验
1．第一链cDNA的合成产物能够直接用于PCR扩增。
2．第一链cDNA的合成产物能够直接用于第二链合成必须调适为能够使用下列产品：
DNA聚合酶
T4 DNA连接酶
核糖核酸酶H
S1核酸酶
五、RNA 操作指南
RNA 抽提纯化是分子生物学研究的基本工作内容。但是由于RNA 酶（RNase）的广泛存在和难以灭活的特性，使RNA 的抽提纯化和后续工作特别困难。
虽然Trizol试剂和各类RNA 抽提纯化试剂盒的广泛应用使RNA 抽提和纯化变得简单易行，但是涉及RNA 的工作仍然是分子生物学研究中最让人感到棘手的。为了保证您的工作顺利进行，请仔细阅读本指南，相信它能帮助您解决常见的问题。
RNA 相关工作中的主要问题是防止RNase的污染。RNase无处不在，在实验操作的任何一步，任何偶然的疏忽或不妥当的操作都有可能造成RNase的污染，从而导致整个实验的失败。因此，严格控制实验条件，避免任何可能的污染，是保证实验成功的关键。
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