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PCR和RT－PCR常见问题及解答

2024-11-18 PCR 加入收藏

问题可能原因建议解决方法RT-PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR 产物RNA 被降解在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA 使用

问题	可能原因	建议解决方法
RT-PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR 产物	RNA 被降解	在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA 使用良好的无污染技术分离RNA 在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA 如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。
RNA 中包含逆转录抑制剂	通过乙醇沉淀RNA 除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA 沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA 的恢复。逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。将对照RNA 同样品混合，同对照RNA 反应比较产量以检验抑制剂。
多糖同RNA 共沉淀	使用氯化锂沉淀RNA 以除去多糖。
用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火	确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。
起始RNA 量不够	增加RNA 量。对于＜50ng的RNA 样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
RNA 模板二级结构太多	将RNA 和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR 产物，保持反应温度≤65℃。注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。
引物或模板对残余的RNA 模板敏感	在PCR 前用RNaseH处理。
靶序列在分析的组织中不表达	尝试其他靶序列或组织
PCR 没有起作用	对两步法RT-PCR ，不要在PCR 步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物
PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR 产物	PCR 引物设计较差	避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
DNA含有抑制剂	诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA
富含GC的模板	对于GC含量＞50％的模板，使用PCR x Enhancer Solution。
模板浓度太低	使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。
镁离子浓度太低	从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR ，使用3mM到5mM的镁离子浓度。
退火温度太高	使用表4 的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。
PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR 产物	引物浓度太低	最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见公式1，2 ）
RT-PCR 特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带	引物和模板非特异性退火	在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。
GSP设计较差	遵循用于扩增引物设计的同样原则
RNA 中沾染了基因组 DNA	使用扩增级DNaseⅠ处理RNA 。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
形成引物二聚体	设计在3'端没有互补序列的引物。
引物和模板非特异性退火	以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR 。避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。
镁离子浓度太高	对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
因为扩增复杂模板导致引物错误起始	使用巢式PCR 或递减PCR 。
沾染外源DNA	使用抗气雾剂的吸头和UDG（见第八章）。
因为二级结构导致引物结合位点无法接近	对于GC含量＞50％的模板，使用（1×-3×）PCR x Enhancer Solution。
PCR 忠实性：PCR 在产物序列中引入了错误	聚合酶忠实性低	使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。
循环数太多	降低循环数。
四种dNTP的浓度不同	制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。
定量RT-PCR 无扩增产量相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照	无cDNA合成
cDNA合成温度太高	降低保温温度
反转录cDNA产物被二级结构封闭	提高保温温度。重新设计引物
RNA 被损害或降解	必要的话更换RNA
RNA se污染	维持无菌条件；加入RNase抑制剂
荧光探针无功能	确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。必要的话设计和合成探针。
灵敏度低须在比预期更高的循环中检出产物	初始模板RNA 不充分	增加模板RNA 的浓度；使用10ng-1µg的总RNA
RNA 被损害和降解	必要的话更换RNA
RNA se污染	维持无菌条件；加入RNase抑制剂
无效的cDNA	通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA 过程中的抑制剂
无效的PCR 扩增	注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺调整cDNA合成温度或引物设计
信号高于预期在低于预期的循环中即可检出产物	反应中加的样品太多	降低模板的浓度
模板或PCR 残余污染	隔离污染来源，更换试剂使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。
电泳后出现意外的条带	RNA 被基因组 DNA污染	用DNase I预处理RNA
用于第一链合成的寡聚dT或随机引物	使用基因特异性引物
PCR 的低特异性	优化PCR 条件