三孢布拉霉结合实验

 一、实验材料：

三孢布拉霉（产β-胡萝卜素， + 菌）Neurospora crassa  CCTCC AF 97006

三孢布拉霉（产β-胡萝卜素， - 菌）Neurospora crassa  CCTCC AF 96002

三孢布拉霉发酵产生β-胡萝卜素：

三孢布拉霉正负菌混合培养会增加其β-胡萝卜素的产量。正、负菌混合培养时属于有性生殖，正、负菌的菌丝体互相接触，可生成有性生殖促进剂三孢酸（在β-胡萝卜素合成过程中存在的一种酶）。此酶主要在八氢番茄红素之后起作用。三孢酸在培养基中能促进上述酶的大量产生，使得八氢番茄红素大量转化为β-胡萝卜素。

二、实验步骤：

 孢子悬液的制备。在无菌条件下，分别挑取斜面培养的三孢布拉霉正、负菌接种到60ml PDA固体培养基的250ml三角瓶中，在30℃恒温培养箱中培养，待菌丝长满后，将三角瓶置于18℃低温下刺激2天，此时可以看到三孢布拉霉正、负菌的菌丝都生成大量孢子。加入60ml含有玻璃珠的灭菌生理盐水，180r/min摇床振荡处理10min。将孢子充分打散，得到孢子悬液。然后吸取1ml孢子悬液到灭菌的离心管中。血球计数板计数后，调整孢子浓度至5ⅹ103个/ml。 将正、负菌按1:2的比例接种到发酵培养基中。接种量为10%。28℃培养。每天对发酵液的生物量及产生β-胡萝卜素进行测定。

 三、实验结果：

结果表明7d时生物量达到最大值，培养基中的糖几乎耗尽。发酵8dβ-胡萝卜素产量达到最大值。

教学建议：

 最佳发酵条件为，初始pH为6.5，装液量为90/250ml。摇床转速为180r/min，发酵温度28℃。

 发酵培养基，葡糖糖100g/L、酵母浸粉12g/、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钠3g/L、七水硫酸镁0.5g/L。

 最佳保存条件：室温保存，可用于一周教学实验。