Ames氏致突变和致癌实验

 实验材料：

菌株：鼠伤寒沙门氏菌突变型TA97（CCTCC AB2014173），TA98（CCTCC AB204062），TA100（CCTCC AB204063），TA102（CCTCC AB2014174）；

培养基：LB培养基，底层葡萄糖基本培养基，表层琼脂培养基（含10% 0.5mmol组氨酸/生物素溶液，2ml/管）；

溶液、试剂及待测物质：滤纸片，氨苄青霉素溶液（8mg/ml），四环素溶液(8mg/ml)，结晶紫溶液(1mg/ml)，秋水仙碱，亚硝酸钠，丙烯酰胺，无菌水。

实验步骤：

1.鉴定实验

（1） 组氨酸营养缺陷（his-）实验

1.1 分别制备底层葡萄糖基本培养基平板和含有0.5mmol组氨酸/生物素溶液（0.2ml/皿）的底层葡萄糖基本培养基平板；

2.2 用无菌棉签蘸取TA97、TA98、TA100和TA102菌悬液，分别划线接种于含组氨酸和不含组氨酸的平板上；

2.3 将平板倒置放入37℃培养箱培养48h，观察菌株生长情况。若菌株只在添加微量组氨酸的平板上生长，而在不含组氨酸的平板上不能生长，则菌株为his-型菌株。

（2）紫外线敏感实验（ΔuvrB实验）

2.1 制备含有0.5mmol组氨酸/生物素溶液（0.2ml/皿）的底层葡萄糖基本培养基平板，用无菌棉签分别蘸取TA97、TA98、TA100和TA102菌悬液在平板上平行划线；

2.2 待菌液浸干后，打开皿盖，用锡箔纸遮盖平板的一半，置于15W紫外灯下照射15s；

2.3 盖上皿盖，置37℃避光培养27h，观察菌株生长情况。只在未经照射一侧的

平板上生长的菌株为ΔuvrB型菌株。

（3）抗氨苄青霉素实验（R因子-抗氨苄青霉素实验）；

3.1 吸取TA97、TA98、TA100和TA102菌悬液0.1ml分别放入盛有2ml表层培养基的试管中（预先加热融化后45℃保温），摇匀后倾倒在底层葡萄糖基本培养基平板上，并使其分布均匀；

3.2 待琼脂凝固后，将一直径约1cm的无菌滤纸片贴在平板上，然后在滤纸片上滴加8mg/ml氨苄青霉素溶液20μl，倒置于37℃培养24h，观察滤纸片周围是否出现抑菌环。

（4）抗四环素实验（质粒pAQ1菌株实验）

4.1 平板制备同3.1

4.2 待琼脂凝固后，将一直径约1cm的无菌滤纸片贴在平板上，然后在滤纸片上滴加8mg/ml四环素溶液20μl，倒置于37℃培养24h，观察滤纸片周围是否出现抑菌环。

（5）结晶紫敏感实验（深粗糙突变，rfa）

5.1 平板制备同3.1

5.2待琼脂凝固后，将一直径约1cm的无菌滤纸片贴在平板上，然后在滤纸片上滴加1mg/ml结晶紫溶液20μl，倒置于37℃培养24h，观察滤纸片周围是否出现抑菌环。

2.致癌物检测（平板渗入法）

（1）制备底层葡萄糖基本培养基平板，置于37℃培养箱中过夜；

（2）菌液准备：分别挑取适量四种缺陷菌株，接种于LB液体培养基中振荡培养10~12h，使菌液浓度达到（1~2）×109个/ml；

（3）表层培养基试管置于45℃水浴备用，依次加入TA97、TA98、TA100和TA102菌悬液0.1ml和待检测致癌物质0.1ml；

（4）表层培养基混匀后，迅速倾倒在底层葡萄糖基本培养基平板上，平放凝固

后，倒置于37℃培养箱48h后观察结果，计数平板上的回变菌落数。

实验结果：

1.鉴定试验

各菌株的鉴定结果如下：

TA97：组氨酸缺陷，结晶紫敏感，紫外线敏感，氨苄青霉素不敏感，四环素敏感；

TA98：组氨酸缺陷，结晶紫敏感，紫外线敏感，氨苄青霉素不敏感，四环素敏感；

TA100：组氨酸缺陷，结晶紫敏感，紫外线敏感，氨苄青霉素不敏感，四环素敏感；

TA102：组氨酸缺陷，结晶紫敏感，紫外线不敏感，氨苄青霉素不敏感,四环素不敏感。

综合以上结果，本实验选用的鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100、TA102均符合Ames实验要求。