A549裸鼠移植瘤模型总结
A549裸鼠移植瘤模型总结首先从细胞培养开始吧。我用的是A549，A549总体感觉还是好养的，也不娇气。A549的培养绝大多数的文献都说用1640，但是我的体会
A549裸鼠移植瘤模型总结
首先从细胞培养开始吧。我用的是A549，A549总体感觉还是好养的，也不娇气。A549的培养绝大多数的文献都说用1640，但是我的体会是用DMEM更好，因为经高人指点，发现A549在偏减性环境长得更好。一开始也是用1640，细胞总是有部分漂起来，即便是用PBS洗后仍然会有部分漂浮。后来换成DMEM,且血清最好用GIBCO的。以后细胞就开始长好了。这种细胞对浓度依赖更强，所以在传得时候浓度要高一点，最好一传二。最好是细胞铺满瓶底80-90%时，就传。传晚了细胞就叠层。有几次传稀了，细胞就集中在一些地方长，没有均匀的铺展开来。甚至细胞就在扎堆的地方叠层生长，也不连接成片，这样的细胞自然不能拿去接种。这样就只能消化下来原瓶传，以后细胞渐入佳境。
到快要接种前两周，我基本上是一天传一次。用于接种的细胞最好传15代后再用，因为代数越高，活力越强，细胞生长非常好。由于我的实验接种的浓度较高，所以我用75cm2的瓶，整整养了99瓶。现在回想起来，真不知当时是怎么熬过来的。主要是A549个头较大，所以75cm2的瓶长的满满的也就在106，如果按文献5×107（大多数文献），我接种60只，还得继续扩大瓶数，不过我发现106数量级就非常好了，不一定必须是5×107。这或许跟我最后细胞的状态有关。另外我发现A549更喜欢玻璃瓶，而且是玻璃瓶越小越好，不知是我的主观感觉还是事实就是这样。因为一开始我是用玻璃瓶养，后来计算，发现用量需很大的量时，才改用75cm2的塑料瓶。
关于细胞养的过程中的一些细节：1）双抗的配制：去一支80万单位的青霉素溶于4ml的NS，再取一支100万单位的链霉素溶于5ml的NS，取4ml与前者混合节。1ml分装与1.5美丽的EP管，-20℃保存，临用前再解冻。2）消化细胞胰酶最好用GIBCO的。可以将胰酶分装在1.5ml的EP管里，每管1ml，-20℃保存，临用前再解冻。3）完培、PBS、胰酶均没必要提前温浴，4℃拿出即可用。4）消化细胞时由于选用GIBCO的，所以没必要在培养箱里消化，室温即可。时间1分钟左右。1ml的胰酶可以重复利用，可消化4瓶细胞，甚至可以消化6瓶，不过越到后面消化所需的时间就越长。这样对细胞不利，因为瓶里没有完培了。当然消化之前必须用PBS洗。如果不洗的话，在吹打时就比较费时费力了。所以洗很关键，因为PBS液可带走残留的血清，以提高酶的活性。5）消化细胞时一定要掌握好火候，镜下观察到细胞连接松散了，即立即停止消化。吸走胰酶用于下一瓶的消化。6）加入完培吹打，此时可沿瓶底快速挤入完培，如果手劲够大的话几乎不用吹细胞都已经掉下来了。吹打时间竟可能短一些，气泡少一些。对于A549来说，可以快速地吹一二十次即可，因为GIBCO的胰酶消化效果非常好。不过反复使用后，应该适当延长消化时间，且尽可能的把PBS吸干净。7）加好完培后轻轻晃一下培养瓶，放入培养箱培养。特别提醒，首次复苏的细胞，不要总去动它，可以第5天再去换液。因为刚复苏的细胞较娇嫩，不易频繁去动它（新手容易犯这样的错误）。
和多数文献一样接种后A549是有些长的慢，我的实验在第18天时，60只里有48只到达遴选标准（100-300mm3），剩下20只，有2/3较小、1/3超过均不能用。我自认为接种成功率比较高了，当然这得益于我身边有一位近40年经验的高人。许多人接种率不高的原因，我个人体会是，除了与你的瘤株的活性（无论你是体外培养，还是体内培养）有密切关系外，还有就是动物的周龄，我个人体会最好4周，动物买来后适应1天就接种。还有后期管理也很重要，特别是NS组，有些人就不给NS，认为没必要，其实很重要，NS组瘤重平均值应该在2g-3g，标准差应在平均值的1/3-1/4，否则数据根本就不可信，实验就是白做。决定成功率的还有一个关紧因素是，接种部位，这个非一日之功。我的成功率较高（姑且自诩一下），正如我前面所说，身边有高人太重要了。所以在这里斗胆建议大家在做类似实验时，身边一定要有高人指点，否则你可能会走很多弯路，这样宁可不做。无论你是用什么鼠，在接种时，首先就是如何抓动物。在抓动物时每一只的手法和力量要尽量一致，抓好后把动物侧面面向自己，此时小鼠的身体呈一弧形，整个侧面的皮肤绷紧。用小手指先压住尾巴，再把右后肢向尾部反向拉一下（注：左手抓动物），再用无名指压住右后肢。此时整个小鼠的、用来注射的侧面的皮肤已经绷得较紧了。这样做的目的是保证细胞悬液在注射后都集中在比较小的区域，不至于四处扩散，反而使局部的浓度减少，影响到成瘤和瘤块的均一性（不过均一的瘤块是可遇不可求的一件事！）。大家可能觉得裸鼠掌握不好注射部位，因为裸鼠的皮肤弹性差。其实裸鼠更好注射，因为裸鼠体表无毛，皮肤是看的见的，有没有在皮下很容易感觉得到。反而是其他有毛的小鼠看不见皮肤，需要小心一点。
进针点的选择你可以选离腋窝大概1.5cm的地方。如果我们从腋窝沿身体的侧面（正俯位的右侧）贴着躯体表面与躯体平行划一根线的话。那么进针点就应该选在离腋窝1.5cm、“线”的左侧。针头进去后应该斜向下（偏右方向）到达腋窝空旷的地方，刚好是6号针头的2/3(注意：针头不能太小，否则易堵。有一次我用4号就有点堵，当时是瘤块的匀浆。)。之前肯定要消毒干净，而且面积大一些好点。因为毕竟裸鼠免疫力低。细胞悬液最好注射在腋窝离得腋下静脉丛周围，且不要伤及静脉。听起来好像很悬吧，其实做多了，感觉就来了。这样就会保证你每只都接种成功。皮下接种最好选择腋下，因为这里血流丰富，可保证瘤块很好的生长。
在无菌室制备好的细胞悬液，最好用一无菌的玻璃瓶（一定要带胶塞）装好，再置于冰面上，再带到动物房注射。许多教科书多说，从消化细胞开始到制备成悬液，再到接种最好在30min内结束，我觉得这有点不切实际。如果是接种一两动物是可以做到的，但几十只时，无论是什么样的高手也做不到。以我为例，我接种60只，我养了99瓶细胞，我从上午8点开始处理细胞，一直到下午3点才把细胞悬液制备好（3个人分工协作），反而是接种只花了30min。
在接种细胞时，每一只动物的用量一定要统一，且注射器在吸得时候也一定要非常准确，这对于将来的成瘤影响很大。每次吸时一定要充分混匀，且摇的次数都要一样，千万不要小看这些细节。由于裸鼠的皮肤弹性有些差，所以当完成注射，将针头拔出时会有明显的针眼，因此在注射完悬液和拔针之前最好下压针头，以免液体从针眼处流出，导致注射的量减少，使瘤块不均一。当然注射前的消毒工作一定要做好，这毋庸置疑。特别是脱碘时一定要干净，否则会将碘带入裸鼠体内，那你就只有哭了。裸鼠太娇贵了。
接种使用组织瘤块好，还是细胞好。要根据你的模型需要决定。我用的A549移植瘤模型就应该选“细胞”，因为A549成瘤慢。如果用“组织瘤块”的话，可能要花3个周期（每个周期20天左右，体内必须传3代后才能用。如果有现成的成瘤裸鼠卖的话就另当别论了，买来就可以用。）
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