序列特异性 DNA 结合蛋白的亲和层析纯化实验-DNA亲和层析法

材料与仪器

制备性的DNA亲和层析树脂
缓冲液Z或其他柱缓冲液（如缓冲液Ze或TM) 配制时含不同的KCl浓度（从缓冲液 Z 0.1 mol L KCl 至缓冲液 Z 1 mol L KCl 对缓冲液Z 0. 1 mol L KCl透析的部分纯化的蛋白质组分 非特异性的竞争DNA 柱再生缓冲液 柱储存缓冲液
一次性的层析柱（Poly-prep Bio-Rad) Sorvall SS-34转子或相当的转子 液氮 硅化的细玻璃棒

步骤

1) 一次性层析柱中1 mL床体积的DNA亲和树脂，用10 mL缓冲液Z/0. 1 mol/L KCl 洗涤2次，进行柱平衡。 

2) 在缓冲液Z/0.1 md/L KCl中将部分纯化的蛋白质组分与非特异性的竞争DNA (由DNA结合研究确定）结合。 

3) 将混合物在冰上孵育10 min。 

4) 12 000 g，4℃离心10 min，以沉淀不溶性的蛋白质-DNA复合物。 

5) 上清在重力作用下加于柱上（如对Sepharose CL-2B柱，15 mL/h)。 

6）加样完毕后，用缓冲液Z/0.1 mol/L KCl洗柱4次，每次2 mL,要淋洗柱的内侧壁。 

在这一步中，分次用2 mL/份洗涤缓冲液淋洗柱内侧壁，从而充分洗涤该亲和柱是十分重要的， 用单独一次8 mL洗达不到效果。 

7)从柱子上洗脱蛋白质，依次加1 mL缓冲液Z/0.2 mol/L、 KCl Z/0.3mol/L KCl、Z/0.4 mol/L KCl 、Z/0.5 mol/L KCl、Z/0.6 mol/L KCl 、Z/0.7 mol/L KCl 、Z/0.8 mol/L KCl、Z/0.9 mol/L KCl之后加 1 mL 缓冲液 Z/1 mol/L KCl 洗 3 次。与所加的1 mL/份缓冲液相应，收集各1 mL级分。将这些蛋白质样品在液氮中速冻， 保存于-80℃。样品一般可保存至少2年。 

8)用DNA结合分析法分析各蛋白质组分中序列特异性DNA结合活性。用SDS-PAGE 电泳及银染观察蛋白质，估计蛋白质组分的纯度。 

如果需要进一步纯化，将具有活性的组分合并，依据KCl浓度，或稀释（用不含KCl的缓冲液 Z),或透析（对缓冲液Z/0.1 mol/L KCl)至0.1 mol/L KC1。然后将该蛋白质组分与非特异竞争性DNA合并，再用新鲜的或再生的DNA亲和介质进行分离。 

如果在柱洗脱液中或流出液中都没有检测到目的蛋白，那么蛋白质可能仍留在柱子里，这就需要 更高浓度的盐溶液（如2 mol/L的KCl)把蛋白质洗脱下来。 

9)按如下方法再生亲和介质：室温下，停止柱流洗，在柱上加5 mL柱再生缓冲液。用一支硅化了的细玻棒搅拌介质，使介质与再生缓冲液混合，让缓冲液流出柱子。重复。 

10)要保存柱子，则加10 mL柱保存缓冲液，让其缓慢流过。重复此步洗涤，然后封闭柱的下端，再加5 mL缓冲液。封闭柱的上端，置于4℃保存。