用克隆化基因在体外合成的蛋白质分析 DNA-蛋白质相互作用
简介
体外合成的蛋白质对于测定一个克隆的基因是否编码一个特异的DNA结合蛋白, 以及分析DNA-蛋白质相互作用都是极为有用的。为了检测DNA的结合能力,可将标 记的蛋白质与特异的DNA片段共温育,用非变性丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质-DNA复 合物与游离的蛋白质分离开来。
基本方案
材料与仪器
制备性的DNA亲和层析树脂
缓冲液Z或其他柱缓冲液(如缓冲液Ze或TM) 配制时含不同的KCl浓度(从缓冲液 Z 0.1 mol L KCl 至缓冲液 Z 1 mol L KCl 对缓冲液Z 0. 1 mol L KCl透析的部分纯化的蛋白质组分 非特异性的竞争DNA 柱再生缓冲液 柱储存缓冲液
一次性的层析柱(Poly-prep Bio-Rad) Sorvall SS-34转子或相当的转子 液氮 硅化的细玻璃棒
步骤
1) 一次性层析柱中1 mL床体积的DNA亲和树脂,用10 mL缓冲液Z/0. 1 mol/L KCl 洗涤2次,进行柱平衡。
2) 在缓冲液Z/0.1 md/L KCl中将部分纯化的蛋白质组分与非特异性的竞争DNA (由DNA结合研究确定)结合。
3) 将混合物在冰上孵育10 min。
4) 12 000 g,4℃离心10 min,以沉淀不溶性的蛋白质-DNA复合物。
5) 上清在重力作用下加于柱上(如对Sepharose CL-2B柱,15 mL/h)。
6)加样完毕后,用缓冲液Z/0.1 mol/L KCl洗柱4次,每次2 mL,要淋洗柱的内侧壁。
在这一步中,分次用2 mL/份洗涤缓冲液淋洗柱内侧壁,从而充分洗涤该亲和柱是十分重要的, 用单独一次8 mL洗达不到效果。
7)从柱子上洗脱蛋白质,依次加1 mL缓冲液Z/0.2 mol/L、 KCl Z/0.3mol/L KCl、Z/0.4 mol/L KCl 、Z/0.5 mol/L KCl、Z/0.6 mol/L KCl 、Z/0.7 mol/L KCl 、Z/0.8 mol/L KCl、Z/0.9 mol/L KCl之后加 1 mL 缓冲液 Z/1 mol/L KCl 洗 3 次。与所加的1 mL/份缓冲液相应,收集各1 mL级分。将这些蛋白质样品在液氮中速冻, 保存于-80℃。样品一般可保存至少2年。
8)用DNA结合分析法分析各蛋白质组分中序列特异性DNA结合活性。用SDS-PAGE 电泳及银染观察蛋白质,估计蛋白质组分的纯度。
如果需要进一步纯化,将具有活性的组分合并,依据KCl浓度,或稀释(用不含KCl的缓冲液 Z),或透析(对缓冲液Z/0.1 mol/L KCl)至0.1 mol/L KC1。然后将该蛋白质组分与非特异竞争性DNA合并,再用新鲜的或再生的DNA亲和介质进行分离。
如果在柱洗脱液中或流出液中都没有检测到目的蛋白,那么蛋白质可能仍留在柱子里,这就需要 更高浓度的盐溶液(如2 mol/L的KCl)把蛋白质洗脱下来。
9)按如下方法再生亲和介质:室温下,停止柱流洗,在柱上加5 mL柱再生缓冲液。用一支硅化了的细玻棒搅拌介质,使介质与再生缓冲液混合,让缓冲液流出柱子。重复。
10)要保存柱子,则加10 mL柱保存缓冲液,让其缓慢流过。重复此步洗涤,然后封闭柱的下端,再加5 mL缓冲液。封闭柱的上端,置于4℃保存。