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生物化学

用克隆化基因在体外合成的蛋白质分析 DNA-蛋白质相互作用

2024-12-06 生物化学 加入收藏
简介体外合成的蛋白质对于测定一个克隆的基因是否编码一个特异的DNA结合蛋白, 以及分析DNA-蛋白质相互作用都是极为有用的。为了检测DNA的结合能力,可将标 记

简介

体外合成的蛋白质对于测定一个克隆的基因是否编码一个特异的DNA结合蛋白, 以及分析DNA-蛋白质相互作用都是极为有用的。为了检测DNA的结合能力,可将标 记的蛋白质与特异的DNA片段共温育,用非变性丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质-DNA复 合物与游离的蛋白质分离开来。

基本方案

材料与仪器

制备性的DNA亲和层析树脂
缓冲液Z或其他柱缓冲液(如缓冲液Ze或TM) 配制时含不同的KCl浓度(从缓冲液 Z 0.1 mol L KCl 至缓冲液 Z 1 mol L KCl 对缓冲液Z 0. 1 mol L KCl透析的部分纯化的蛋白质组分 非特异性的竞争DNA 柱再生缓冲液 柱储存缓冲液
一次性的层析柱(Poly-prep Bio-Rad) Sorvall SS-34转子或相当的转子 液氮 硅化的细玻璃棒

步骤

1) 一次性层析柱中1 mL床体积的DNA亲和树脂,用10 mL缓冲液Z/0. 1 mol/L KCl 洗涤2次,进行柱平衡。 

2) 在缓冲液Z/0.1 md/L KCl中将部分纯化的蛋白质组分与非特异性的竞争DNA (由DNA结合研究确定)结合。 

3) 将混合物在冰上孵育10 min。 

4) 12 000 g,4℃离心10 min,以沉淀不溶性的蛋白质-DNA复合物。 

5) 上清在重力作用下加于柱上(如对Sepharose CL-2B柱,15 mL/h)。 

6)加样完毕后,用缓冲液Z/0.1 mol/L KCl洗柱4次,每次2 mL,要淋洗柱的内侧壁。 

在这一步中,分次用2 mL/份洗涤缓冲液淋洗柱内侧壁,从而充分洗涤该亲和柱是十分重要的, 用单独一次8 mL洗达不到效果。 

7)从柱子上洗脱蛋白质,依次加1 mL缓冲液Z/0.2 mol/L、 KCl Z/0.3mol/L KCl、Z/0.4 mol/L KCl 、Z/0.5 mol/L KCl、Z/0.6 mol/L KCl 、Z/0.7 mol/L KCl 、Z/0.8 mol/L KCl、Z/0.9 mol/L KCl之后加 1 mL 缓冲液 Z/1 mol/L KCl 洗 3 次。与所加的1 mL/份缓冲液相应,收集各1 mL级分。将这些蛋白质样品在液氮中速冻, 保存于-80℃。样品一般可保存至少2年。 

8)用DNA结合分析法分析各蛋白质组分中序列特异性DNA结合活性。用SDS-PAGE 电泳及银染观察蛋白质,估计蛋白质组分的纯度。 

如果需要进一步纯化,将具有活性的组分合并,依据KCl浓度,或稀释(用不含KCl的缓冲液 Z),或透析(对缓冲液Z/0.1 mol/L KCl)至0.1 mol/L KC1。然后将该蛋白质组分与非特异竞争性DNA合并,再用新鲜的或再生的DNA亲和介质进行分离。 

如果在柱洗脱液中或流出液中都没有检测到目的蛋白,那么蛋白质可能仍留在柱子里,这就需要 更高浓度的盐溶液(如2 mol/L的KCl)把蛋白质洗脱下来。 

9)按如下方法再生亲和介质:室温下,停止柱流洗,在柱上加5 mL柱再生缓冲液。用一支硅化了的细玻棒搅拌介质,使介质与再生缓冲液混合,让缓冲液流出柱子。重复。 

10)要保存柱子,则加10 mL柱保存缓冲液,让其缓慢流过。重复此步洗涤,然后封闭柱的下端,再加5 mL缓冲液。封闭柱的上端,置于4℃保存。 

 


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