组织薄片膜片钳全细胞记录实验

通过全细胞膜片钳技术来检测组织薄片（脊髓片或脑片）上神经元的突触后电位、突触后电流及该突触后电位或电流的可塑性改变等现象。组织薄片膜片钳技术与分散细胞膜片钳技术相比，具有的优点是组织薄片中的细胞更接近在体的原始环境，很好地保持了神经元之间的突触联系。

材料与仪器

步骤

1脑片的制备

(1)动物麻醉后断头并取出脑组织放入冰冻的孵育细胞外液中，该孵育细胞外液预先用95%02和5%CO2饱和，冰冻的程度以冰水混合液为好。

(2)将脑组织块粘在切片台上，用振动切片机切取200-300µm厚的脑片。

(3)将切下来的脑片移至孵育槽中进行孵育，持续通以95% C02和5%C02的混合气，1h后开始进行记录。

2.脊髓薄片的制备

(1)动物腹腔注射乌拉坦麻醉，剂量为1.2-1.5mg/kg。

(2)沿中线切开背部皮肤和肌肉，行椎板切除术，暴露脊髓。

(3)在胸段横断脊髓，提起残端，用维纳斯剪逐次剪断髓旁背根及腹根，使目标节段背根保留3-5mm以上长度，取出脊髓腰膨大脊髓。

(4)在显微镜下进行撕膜等操作，保留一侧脊神经L4或L5背根，撕去其他所有前根及背根，并仔细除去脊髓表面硬脊膜和蛛网膜。

(5)将带有L4或L5背根的脊髓放置于带有90°凹槽的琼脂块上。

(6)将琼脂块粘于切片槽上，注意使脊髓尾侧向上。将冰水混合孵育细胞外液倒入切片槽，保证脊髓直立，目的节段背根悬浮在脊髓一侧。

(7)Vibrotom震动切片机速度调至1-2,振幅调至7-8,在目的节段背根根部上方及下方进刀。在上方进刀时用摄子轻压背根，使之处于刀片下方；在下方进刀时，用镊子轻提背根未端，使刀片从其根部下方通过，切片厚度保持在350-450µm。

(8)将切片中摄子夹持过的背根未段剪断。

(9)用吸管将切好的脊髓薄片置于通有95%02和5%CO2的混合气的孵育细胞外液中，孵育1h后，转入记录细胞外液中进行膜片钳实验。

3.组织薄片的观察和记录：

(1)记录槽中灌流液的持续灌流可能会引起组织薄片的飘动，因此为了保证记录的稳定，需要将组织薄片固定。通常将一个铅金丝制成一个开口的矩形框，上面间隔一定距离用502胶将尼龙丝绷直粘牢。将这样一个铅金压片网压在组织薄片上可以很好地将薄片固定。

(2)在红外可视条件下，选择表面光滑、轮廓清晰的神经元进行封接，进行全细胞记录（图3-10)。

(3)以脊髓薄片上的记录为例，显示不同突触后电流形式的记录方法。刺激背根诱发的兴奋性突触后电流(evokedEPSC,简称eEPSC)。在钳制电压为-70mV,记录液中加入Strychnin(甘氨酸受体阻断剂）和Bicuculin(GAB凡受体阻断剂）以及AP-5(NMDA受体阻断剂）的条件下，通过吸引电极给予后根施加0.2Hz的方波刺激(DurationI00µs),直到记录到诱发的eEPSC。根据刺激强度阈值和传导速度判断eEPSC是由哪类初级传入纤维介导的，因脊髓背角浅层主要接受伤害性信息的传入，所以所记录到的eEPSC主要是由Aδ或C类纤维介导的。A&纤维诱发的eEPSC的刺激强度阙值一般为10-60µA,传递速度为2-13m/s;而C纤维诱发的eEPSC的刺激强度阙值一般为160-530µA,传递速度一般小于0.8m/s。根据高频刺激(20Hz或2Hz)是否引起eEPSC出现诱发失败和潜伏期是否一致来判断eEPSC是经初级传人纤维单突触传递介导的还是经脊髓背角中间神经元中介的多突触传递介导的（图3-11片对于Ao纤维诱发的eEPSC,我们通常采用20Hz刺激连续刺激20次，如果每次eEPSC都能成功诱发（即不出现诱发失败现象）及潜伏期保持一致的话，我们认为该eEPSC为单突触介导，否则为多突触介导；对于C纤维诱发的eEPSC,我们通常采用2Hz刺激连续刺激20次，如果每次eEPSC都能成功诱发（即不出现诱发失败现象）及潜伏期保持一致的话，我们认为该eEPSC为单突触介导，否则为多突触介导。自发兴奋性突触后电流(sEPSC)和微小兴奋性突触后电流(mEPSC)。在钳制电压为-70mV,记录液中加入Strychnin(甘氨酸受体阻断剂）和Bicuculin(GAB凡受体阻断剂）以及AP-5(NMDA受体阻断剂）的条件下，不施加任何外界刺激在脊髓背角神经元上记录到的自发产生的兴奋性突触后电流即为sEPSC。进一步加入TTX阻断细胞之间的动作电位传递之后，即可记录到微小兴奋性突触后电流（即mEPSC)。抑制性突触后电流(IPSC)。在钳制电压为-70mV,记录液中加入CNQX(AMPA受体阻断剂）和AP-5(NMDA受体阻断剂）的条件下便可记录到抑制性突触后电流(IPSC)。IPSC包括GAB凡受体介导的IPSC和甘氨酸受体介导的IPSC,前者可由记录外液中加入Strychnin所分离，后者可由记录外液中加入Bicuculin所分离。

注意事项

1.注意切片时整个系统温度应保持在O℃左右，即要用碎冰对刀片及切片槽周围进行降温。

2.选择健康的细胞进行钳制是保证实验高效、结果准确的一个关键因素。

3.脊髓撕膜时注意不要牵拉背根，可用剪刀将非目的节段背根剪掉。

常见问题

1整个实验过程中组织薄片的制备非常关键，因为切片的质量直接决定细胞状态的好坏和实验的成功与否。尤其是在带后根脊髓薄片的制作过程中，一定要注意动作轻柔、切莫大刀阔斧，尤其要注意对后根及后根进入区的保护，因为此处非常脆弱，一旦遭到损伤，即使神经元状态再好也记录不出刺激后根诱发的反应。

2.溶液配制：

1.孵育细胞外液，含NaCl 95mM,KCl 1.8mM,KH2P04 1.2mM,CaCl2 0.5mM,MgS04 7mM,NaHC03 26mM,glucose 15mM,sucrose 50mM,通以含95%02与5%CO,混合气体、pH调至7.4,渗透压调至310-320mOsm。

2.记录细胞外液，含NaCl 127mM,KCI 1.8mM,KH2P04 I.2mM,CaC12 2.4mM,MgS04 1.3mM,NaHC03 26mM,glucose 15mM,sucrose 0mM,通以含95%02与5%C02混合气体，pH调至7.4,渗透压调至310-320m0sm。

3.细胞内液，含potassium gluconate 120mM,KCl 20mM,MgCl2 2mM,Na2ATP 2mM,NaGTP 0.5mM,HEPES 20mM,EGTA 0.5mM,用KOH将pH值调至7.28,将渗透压调至 300m0sm.,

4.将孵育细胞外液首先通混合气(95%02,5%C02)半小时至氧饱和状态，取出200ml置冰箱冰冻至冰水混合状态，其余液体继续保持混合气通灌。