由酶循环确定烟酰胺核苷酸实验-NADP（H） 的测定

为了测定 NADP（H），可以采用谷氨酸脱氢酶（GluDH）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH） 的偶联反应：

在指定的条件下，一个 NADP 分子可以催化生成 5000～10 000 个 6-磷酸葡萄糖酸盐。NADP的浓度为 10-9 mol/L（1 ul 含有 10～15 mol）时就可以检测到。ADP 作为 GluDH 的催化剂。

停止酶循环反应后，可以利用一个独立的 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶反应来测定 6-磷酸葡萄糖酸盐的生成量：

材料与仪器

NADP
Tris-HCl α-酮戊二酸 D-葡萄糖-6-磷酸盐 ADP 乙酸胺 BSA 谷氨酸脱氢酶 葡萄糖 6-磷酸脱氢酶 6-磷酸葡萄糖酸盐 EDTA 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶
荧光光度计

步骤

实验所需「试剂」具体见「其他」

1. NADP 或 NADPH 的测定

0.1 ml 循环混合物：

被测定的 x ul NADP 或 NADPH 溶液［x 为 1～20； 浓度为（3～50）×10-9 mol/L］。

（20～x）ul 0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0

37 ℃ 培养 30 min

将样品转移到 100℃、2 min 来终止反应。

2. 6-磷酸葡萄糖酸盐的荧光测定

在发射 470 nm（激发 325 nm）处测定荧光、实验可以通过 6-磷酸葡萄糖酸盐标准曲线来定量。

常见问题

试剂：

0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0

0.1 mol/L α-酮戊二酸（二钠盐，Mr＝190.1；190 mg 溶于 10 ml 水中）

0.1 mol/L D-葡萄糖-6-磷酸盐（二钠盐，氢氧化物，Mr＝304.1；304 mg 溶于 10 ml 水中）

0.01 mol/L ADP（二钠盐，Mr＝471.2；47.1 mg 溶于 10 ml 水中）

1.0 mol/L 乙酸胺（Mr＝77.1；771 mg 溶于 10 ml 水中）

BSA（20 mg/ml）；

谷氨酸脱氢酶（来自于牛肝脏，40 U/mg，配制好的溶液：40 U/0.1 ml 0.1mol/L Tris-HCl，pH 8.0）

葡萄糖 6-磷酸脱氢酶（来自于酵母，300 U/mg，配制好的溶液： 60 U/0.1ml 0.1mol/L Tris-HCl，pH 8.0）

0.01 mol/L 6-磷酸葡萄糖酸盐（三钠盐，Mr＝342.1；34 mg 溶于 10 ml 水中）

0.01 mol/L NADP（Mr＝787.4；79 mg 溶于 10 ml 水中）

0.1 mol/L EDTA（Mr＝292.2；292 mg溶于 10 ml 水中）

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（来自于产朊假丝酵母，20 U/mg； 配制好的溶液：0.1 U/0.1 ml 0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0）